Для начала получите экструдированные сегменты агарозы из градиентных шприцев, инокулированных либо диким типом, либо мутантными видами метиломонов, LW13. Добавьте 0,75 мл 0,85% хлорида натрия в воду к экструдированному образцу агарозы и гомогенизируйте путем вортексирования. Далее разведите образец от 1 до 10 в новой микроцентрифужной пробирке с 900 микролитрами раствора соли.
Инкубируйте образцы с тремя микролитрами смеси SYTO 9 и йодида пропидиума один к одному в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Чтобы определить количество клеток на миллилитр агарозы, обработайте микросферу подсчетной суспензией на водяной бане в течение пяти минут. Затем добавьте в образец 10 микролитров суспензии перед анализом проточной цитометрии.
Анализируйте образцы с помощью проточного цитометра. Сравните графики бокового рассеяния и прямого рассеяния между бесклеточными контрольными образцами и инокулированными образцами агарозы, чтобы нарисовать затворы напряжения бактериального события, исключающие фоновые частицы агарозы. Чтобы подсчитать колониеобразующие единицы в градиентном шприце, добавьте 800 микролитров нитратных минеральных солей в среду экструдированного агарозного сегмента и вихря в течение 10 секунд, чтобы помочь в пипетировании.
Приготовьте стерильную 96-луночную пластину со 180 микролитрами нитратной минеральной соли среды в каждой лунке. Добавьте по 20 микролитров разведенного образца агарозы в каждую лунку в первой колонке и перемешайте. С помощью многоканальной пипетки последовательно разбавляйте 20 микролитров образцов в десять раз, начиная с первого ряда лунок.
Наклейте этикетку квадратной сеткой, пластиной, содержащей нитраты, минеральные соли, шнеком или средой по выбору. С помощью многоканальной пипетки нанесите пять микролитров из колонки 96-луночного планшета на шнековую пластину. Проточная цитометрия с использованием экструдированных образцов агарозы подтвердила, что мутант делеции OAT LW13 показал снижение роста клеток по сравнению со штаммом дикого типа.
Комплементация мутанта геном OAT восстановила количество клеток и образование полос до уровней, аналогичных дикому типу, что указывает на специфическую роль гена в образовании полос.
