Для начала окрашивайте клетки костного мозга мыши с помощью Hoechst 33342. Для проточной цитометрии запустите необходимое программное обеспечение, затем выберите стандартизацию контроля качества. Вставьте пробирку для контроля качества или QC FluoroSphere в держатель пробирки перед нажатием кнопки «Начало», чтобы начать процедуру контроля качества.
Чтобы создать новый эксперимент, нажмите «Новый эксперимент» в меню «Файл», укажите путь к файлу и сохраните эксперимент. Затем выберите «Задать канал» в меню «Настройки». Установите флажок сигнала канала и добавьте имя реагента в столбец метки.
Затем нажмите на значок графиков псевдоцветом в области графика, чтобы создать графики. Нажмите «Добавить пробирку» на экране пробирки, чтобы создать новые образцы пробирок и изменить их имена. Затем нажмите кнопку Выполнить, чтобы загрузить образец, просмотреть графики и установить стропы.
Отрегулируйте параметры усиления и пороговых значений и выберите Запись, чтобы сохранить данные. Чтобы спроектировать логику настройки стробов, щелкните ось X, чтобы выбрать FSEW, и щелкните ось y, чтобы выбрать FSEA. Выберите Многоугольный вентиль, чтобы нарисовать строп А, чтобы обвести отдельную ячейку и исключить смежные клетки.
Для второго графика щелкните по оси X, чтобы выбрать FSEA, и щелкните по оси y, чтобы выбрать SSEA. Выберите Полигональный вентиль, чтобы нарисовать вентиль B для разделения нефрагментарных ячеек и исключения клеточного мусора. Для третьего графика щелкните по оси X, чтобы выбрать PIA, и по оси y, чтобы выбрать SSEA.
После рисования затвора В выберите живые клетки с отрицательным иодидом пропидия и нарисуйте затвор С, чтобы получить живые клетки. Для четвертого двумерного графика щелкните по оси X, чтобы выбрать Hoechst Red, и щелкните по оси y, чтобы выбрать Hoechst Blue. Щелкните правой кнопкой мыши на графике и выберите «Свойство» в раскрывающемся меню.
Выберите линейный формат для оси X и оси Y и нарисуйте вентиль для боковых ячеек популяции. Используйте лазеры 355 нм и 405 нм одновременно для обнаружения как контрольных, так и экспериментальных ячеек. Регистрируйте флуоресцентные сигналы на каналах 690 x 50 и 450 x 50 нанометров, соответствующих двум лазерам.
Наблюдайте за эффективной стимуляцией красителя Hoechst 33342 с помощью лазеров с яркостью 355 и 405 нанометров для визуализации клеток популяции на чистой стороне. Для обнаружения одних и тех же образцов используйте лазеры 375 и 405 нанометров. Лазер с яркостью 355 нанометров эффективно возбуждал краситель Hoechst 33342, в результате чего было получено четкое наблюдение за SP-клетками костного мозга.
SP-ячейки одних и тех же образцов, обнаруженных 355-нанометровым лазером и 405-нанометровым лазером, оказались по существу идентичными. Как 375 нанометровый, так и 405 нанометровый лазеры эффективно возбуждали Hoechst 33342 для получения SP-ячеек.
