Разработка монослоя эпителия яичников человека и органоидов для изучения регенерации и лекарственных эффектов

Для начала разморозьте криоконсервированные эпителиальные клетки поверхности яичников человека. Смешайте клетки с 10 миллилитрами моющей среды. После центрифугирования клеток ресуспендируйте гранулу в двух миллилитрах поверхностного эпителия яичников или среды OSE 2D и перенесите ее в две лунки 12-луночного планшета.

Добавьте в лунку один миллилитр дополнительной среды OSE 2D и закваливайте при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение 72 часов до первого обновления среды. Используйте окрашивание Trypan Blue для подсчета свежевыделенных или криоконсервированных размороженных эпителиальных клеток поверхности яичников человека с помощью автоматического счетчика клеток. Смешайте нужное количество клеток в одном миллилитре ледяной органоидной основной среды OSE и центрифугируйте пробирку при 240 G в течение пяти минут.

С помощью пипетки ресуспендировать клеточную гранулу в ледяном неразбавленном растворе экстракта базальной мембраны до получения 10 000 клеток на 10 микролитров. Добавьте 10 микролитров капли экстракта базальной мембраны OSE на лунку в предварительно нагретую многолуночную камерную горку и поместите пластину вверх дном при температуре 37 градусов Цельсия во увлажненный инкубатор с 5% углекислым газом на 15 минут. После того как гель застынет, добавьте 100 микролитров среды OSE 3D и культуру при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненный инкубатор с 5% углекислым газом.

После удаления отработанной среды добавьте в каждую лунку по 100 микролитров ледяного усовершенствованного DMEM F12. Соскребите дно лунок наконечником пипетки P1000, чтобы отделить капли геля, и перенесите каждую плавающую каплю геля в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 240 G в течение пяти минут.

После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 300 микролитрах буфера для диссоциации клеток и поместите пробирки в предварительно нагретую ванну с шариками при температуре 37 градусов Цельсия на 5-10 минут. Далее добавьте 300 микролитров основной среды органоида OSE человека и центрифугируйте при 240 G в течение пяти минут. Наконец, повторно суспендируйте гранулы в желаемом объеме неразбавленного раствора экстракта базальной мембраны, чтобы повторно засеять их в подходящем соотношении для культивирования.

Первичные человеческие клетки OSE демонстрировали булыжниковую морфологию вплоть до третьего пассажа, но после этого демонстрировали признаки старения. Человеческие органоиды OSE из свежевыделенных клеток OSE выросли больше, чем из 2D-расширенных клеток OSE после 14 дней в культуре. В 3D органоидах OSE наблюдались различные морфологии, включая кистозные, монослойные, многослойные и нелюменизированные клеточные кластеры.