Для начала возьмите свиные глазки, помещенные в литровый стакан. Подержите глазное яблоко пинцетом и удалите лишние ткани глаза ножницами в стерильной пластине Петри. Для раны эпителия удерживайте глазное яблоко стерилизованными безворсовыми салфетками и отметьте центр роговицы шестимиллиметровым трепаном.
Затем с помощью небольшого скальпеля или затупленного мягкого лезвия бритвы аккуратно соскребите эпителиальные клетки в круге, отмеченном трепанами. Удалите весь клеточный мусор, убедившись, что базальная мембрана остается неповрежденной. После этого очистите область раны ватными палочками.
С помощью скальпеля и ножниц рассеките глазное яблоко, разрезав вдоль корнеосклеральных ободков. Затем промойте роговицы в стерилизованном 500-миллилитровом стакане, содержащем PBS. Далее поместите иссеченные роговицы вверх ногами в стерильную форму.
Заполните эндотелиальную полость роговицы минимальной эфирной средой (MEM), содержащей 1% агарозы, поддерживаемой при 48 градусах Цельсия. Теперь переверните и переложите роговицы в 35-миллиметровую тарелку. Добавьте два миллилитра MEM с тестируемым агентом или без него по каплям на поверхность центральной роговицы, убедившись, что область лимбальной конъюнктивы покрыта, оставляя эпителий открытым воздухом.
Затем поместите чашки для культуры во увлажненный инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Через 40 часов после раны окрасьте поврежденную культивированную роговицу раствором для окрашивания Ричардсона. Промойте окрашенные роговицы PBS перед их фотографированием.
Затем используйте трепан того же размера, чтобы отметить первоначальную рану, и с помощью небольшого скальпеля соскребите эпителиальные клетки внутри отмеченных кругов. Извлеките собранные ячейки и переложите их в предварительно охлажденную центрифужную трубку. Оставшаяся площадь раны была значительно больше у роговиц, обработанных непафенаком 0,1%, по сравнению с роговицами, обработанными бромфенаком 0,09% и кеторолаком 0,45%, Роговица, обработанная LL-37 в концентрации 0,2 и 0,5 мкг на миллилитр, показала значительно ускоренное заживление ран в условиях высокого уровня глюкозы по сравнению с необработанными роговицами.
