Для начала поместите изображения здоровых и выродившихся глаз мухи дрозофилы в ту же папку. Убедитесь, что файлы имеют соответствующие имена, чтобы идентифицировать экспериментальные группы и различать самцов и самок. Откройте программу Ilastik.
Нажмите на кнопку «Создать новый проект». Затем в разделе Другие рабочие процессы выберите Подсчет плотности ячеек и выберите место для сохранения файла проекта. Последовательно нажмите на 1.
Введите данные, добавьте новые и добавьте отдельные изображения, чтобы выбрать стандартное изображение. Затем нажмите на 2. Feature Selection и выберите функции.
Выберите больше значений сигма для повышения чувствительности. Нажмите на 3. Подсчитываем и устанавливаем значение сигмы переднего плана равным 5.00.
С помощью инструмента переднего плана отметьте на стандартном изображении 50 или более отдельных омматидий. Нажмите на 3. Снова подсчитываем и с помощью инструмента фона отмечаем область за пределами омматидии.
Нарисуйте зеленые линии в форме решетки вокруг омматидии. Нажмите на 4. Экспорт плотности и выберите «Экспорт настроек изображения», чтобы настроить параметры изображения.
Затем нажмите на Output File Info и выберите формат tiff для дальнейшего анализа в Flynotyper. Нажмите на 5. Пакетная обработка, выберите файлы необработанных данных и выберите все экспериментальные фотографии мух для анализа.
Список импортированных изображений для анализа приведен в разделе «Выбрать файлы необработанных данных». Нажмите «Обработать все файлы» в нижней части списка 5. Раздел «Пакетная обработка».
После того как программа завершит обработку, проверьте папку, содержащую экспериментальные изображения «глаза мухи». Убедитесь, что названы черные изображения, вероятности названия образца, присутствуют. В программе ImageJ откройте файл tiff, сгенерированный Ilastik.
С помощью инструмента выделения прямоугольника создайте прямоугольник вокруг глаза. Выберите Control X или Control C, чтобы обрезать область, и подождите, пока не появится черный прямоугольник в форме контура прямоугольника. Последовательно нажмите «Файл», «Создать» и «Внутренний буфер обмена», чтобы открыть обрезанный глаз мухи.
Чтобы сохранить вырезанный глаз мухи в формате JPEG, нажмите «Файл», «Сохранить как» и «JPEG». В ImageJ нажмите на Плагины и Flynotyper. В разделе Генотипы выберите Добавить генотипы и откройте папку, содержащую изображения вырезанных глаз мухи.
Отметьте галочками поля «Световой микроскоп» и «Вертикально». Затем в разделе «Ранжирование Омматидии по» отметьте поля «Стабильность» и «Расстояние до центра». Для количества рассматриваемых омматидий с ранжированием установите значение 200.
Нажмите кнопку Run и дождитесь появления результатов анализа. Скопируйте и вставьте файл образца и P-оценку в статистическое программное обеспечение для дальнейшего анализа. Изображения глаз дрозофилы, обработанные с помощью Ilastik и проанализированные в кольцевом свете, показали более четкие омматидиальные узоры по сравнению с изображениями без кольцевого света, что повысило качественную оценку.
Анализ Flynotyper показал значительно более высокие фенотипические показатели в глазах мух с умеренной и тяжелой дегенерацией по сравнению с недегенерированными глазами. Когда Иластик не использовался, P-баллы между недегенерированными и умеренно дегенерированными глазами были схожими.
