Для начала подготовьте увлажненную камеру, взяв большую задвижку и сняв картонную крышку, прилипшую к крышке. Положите влажные бумажные полотенца вертикально у основания выдвижной коробки, убедившись, что они лежат ровно. Подготовьте предметное стекло к окрашиванию путем депарафинизации, регидратации, забора антигена и стирки.
Снимите предметное стекло с PBS и сотрите излишки PBS, избегая салфетки. С помощью гидрофобной ручки нарисуйте коробку вокруг ткани, чтобы сформировать барьер. Расположите горку контура горизонтально над влажными бумажными полотенцами.
Добавьте примерно 100 микролитров блокирующего буфера, чтобы покрыть ткань. Закройте увлажненную камеру и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 90 минут. Затем аккуратно постучите по блокирующему раствору.
Сразу же добавляем подготовленный блок «мышь-мышь», чтобы покрыть ткань и выдерживаем при комнатной температуре 15 минут. В конце инкубации извлеките предметные стекла из увлажненной камеры и поместите их непосредственно в решетку для слайдов, погруженную в PBS. Затем удалите слайды из PBS.
Аккуратно постучите по излишкам PBS и поместите их горизонтально обратно во увлажненную камеру. Добавьте соответствующим образом разведенные первичные антитела, представляющие интерес, чтобы покрыть ткань. После того, как предметные стекла будут извлечены из увлажненной камеры, аккуратно постучите по первичным антителам и поместите предметные стекла в решетку для предметных стекол, погруженную в PBS, на пять минут.
После снятия предметных стекол с PBS и отстукивания излишков PBS поместите их горизонтально обратно в увлажненную камеру. Добавьте соответствующим образом разведенные флуорофоры вторичных антител или конъюгированные первичные антитела, представляющие интерес, для покрытия ткани. Затем добавьте соответствующим образом разведенный Huist непосредственно на ткань перед инкубацией при комнатной температуре в темноте.
После этого поместите предметные стекла в новую устойчивую к растворителям посуду, наполненную PBS, на пять минут в темноте. Удаляйте по одному слайду за раз, сохраняя оставшиеся слайды погруженными в PBS в темноте. После удаления избытка PBS добавьте одну-две капли монтажной среды, препятствующей выцветанию, в центр ткани.
Держите чистую крышку за края и медленно опустите ее на предметное стекло под углом 45 градусов. Начиная с центра ткани, аккуратно надавите на покровную листушку двумя пальцами. Приложите отрезанную нефильтрованную пипетку P200 к кончику серологической пипетки, подключенной к вакууму.
Следуя за краями защитного накладки, используйте пылесос, чтобы удалить излишки монтажной среды. В новой коробке слайдов горизонтально положите предметное стекло, прежде чем дать ему высохнуть в темноте при комнатной температуре. Микроскопические изображения показали морфологию различных сегментов кишечника и окрашивание бокаловидных клеток.
Апикальная мембрана, латеральная мембрана эпителиальных клеток и ядра. Иммунофлуоресцентное окрашивание кишечника выявило множество различных клеточных компартментов, включая пролиферативные клетки, интерстиций, лизосомальный домен и эпителий.
