Для начала добавьте 500 микролитров безбелкового буфера изображения в канал 3 проточной ячейки. Смешайте два наномоляра Saccharomyces cerevisiae NAP1 и два-пять наномоляров меченного LD655 октамера гистонов H4 с 500 микролитрами 1X HR буфера. Добавьте эту смесь в канал 4 проточной ячейки.
Влейте все каналы под давлением 1,0 бар в течение 30 секунд, чтобы промыть их образцами. Установите поток на 0,2 бар и переместите оптические ловушки в положение канала 1, чтобы поймать подходящую пару шариков, покрытых стрептавидином. Далее переместите оптические ловушки на канал 3.
Выключите поток и проведите принудительную калибровку для пары шариков. Включите красный конфокальный лазер и откалибруйте область визуализации. Установив поток на 0,2 бар, переместите оптические ловушки в канал 2, чтобы поймать биотинилированную ДНК.
Затем переместите оптические ловушки на канал 3 и остановите поток. Увеличьте расстояние между оптическими ловушками, чтобы растянуть ДНК, и отслеживайте связанную с этим кривую принудительного расстояния, чтобы подтвердить наличие одного троса ДНК. Отрегулируйте расстояние между оптическими ловушками так, чтобы натяжение ДНК составляло примерно один пиконьютон.
Включите линейное сканирование, чтобы начать сбор кимографа с включенным красным лазером. Затем переместите оптические ловушки в канал 4 с отключением потока, чтобы сформировать нуклеосомы вдоль троса ДНК. Для раскрытия нуклеосом переместите оптические ловушки в канал 3.
Установив значение силы 0 и скорость 0,1 микрометра в секунду, переместите оптическую ловушку 1 в сторону от оптической ловушки 2. Смешайте 10 наномоляров Cy3-меченного линкера гистона H1.4 с 500 микролитрами буфера изображения и добавьте в канал 5. После формирования троса ДНК, содержащего нуклеосомы, включите зеленый лазер в дополнение к красному лазеру и переместите оптические ловушки на канал 5 для визуализации связывания H1 с хроматином в реальном времени.
Образование нуклеосом вдоль троса ДНК визуализировалось в виде неподвижных красных флуоресцентных очагов на 2D-сканировании и кимографе. Анализ фотообесцвечивания показал одноэтапное или двухэтапное фотообесцвечивание, указывающее на наличие мононуклеосом. В отсутствие NAP1 октамеры гистонов связывались с ДНК, но оставались в основном неразвернутыми, о чем свидетельствовало постоянное напряжение.
С использованием меченого Cy3 H2A были получены аналогичные результаты сборки нуклеосом, как и с меченым LD655 H4. Разворачивание нуклеосом со временем увеличивало расстояние троса, видимое на кимографе, и генерировало вынужденные кривые расстояний с характерными разрывами, которые обозначают разворачивание отдельных нуклеосом. Связывание линкерного гистона H1 с хроматином было обозначено зелеными флуоресцентными очагами с двухцветными стационарными траекториями, представляющими связывание H1 с нуклеосомами, и зелеными зубчатыми траекториями, представляющими собой диффузные траектории H1.
