Для начала поместите на рабочую платформу реагенты, необходимые для приготовления гель-электрофореза. Добавьте Tris/Borate/EDTA, или TBE, в агарозу и нагрейте раствор в микроволновой печи. Затем вылейте 0,4-0,5% агарозы в формовочный противень, чтобы приготовить первый размерный агарозный гель, и дайте ему застыть в течение часа.
После застывания нагрузите лестницу в пределах первых 3 сантиметров относительно крайнего левого края геля. Затем загрузите образцы ДНК, переваренные ферментами рестрикции, обеспечивая расстояние между каждой парой в 3 сантиметра. Запустите гель в TBE в течение 19-24 часов при напряжении 0,85 вольт на сантиметр, чтобы разделить промежуточные продукты по размеру.
На следующий день удалите гель из буфера. Вырежьте первые 3 сантиметра геля, содержащего лесенку. Окрашивают гелевый сегмент в КЭ, содержащий 0,3 мкг на миллилитр бромида этидия, в течение 10-15 минут.
Затем визуализируйте лестницу с помощью системы документирования геля. На агарозном геле прибавьте 1,3 сантиметра к предполагаемому местоположению, получив значение А. Затем вычтите 7,5 сантиметра из значения А, получив значение В. Выровняйте линейку относительно геля первого измерения и разрежьте горизонтально поперек на значениях А и В. Затем отрежьте вертикально 3 сантиметра пространства, отведенного для каждого образца. В новом литейном лотке поверните сегменты по часовой стрелке и разместите их на месте лунок для образцов.
Приготовьте агарозный гель второго измерения в концентрации 1-1,3% в КЭ с 0,3 мкг на миллилитр бромида этидия. Нагрейте гель и, охладив примерно до 55 градусов Цельсия, налейте его на вращающиеся сегменты первого измерения. Дайте гелю застыть в течение часа.
После застывания перенесите гель в камеру, содержащую КЭ в концентрации 0,3 микрограмма на миллилитр бромида этидия, и дайте ему уравновеситься в течение 30 минут. Накройте гель и работайте 9-10 часов при напряжении 4,23 вольта на сантиметр при 4 градусах Цельсия. Извлеките из камеры гель второго измерения и очистите фрагменты ДНК в течение 10 минут в растворе соляной кислоты 0,24 моляра с легким покачиванием.
Смойте гель деионизированной водой и замочите его в 0,4 моляре гидроксида натрия на 10-15 минут. Затем сложите два длинных листа хроматографической бумаги перпендикулярно стеклянному листу, расширяясь внутрь контейнера. Чтобы собрать южный блот, заполните емкость 1 литром 0,4 моляра гидроксида натрия.
Выровняйте длинный стеклянный лист поперек контейнера. Намочите верхнюю часть бумаги гидроксидом натрия и тщательно удалите любые пузырьки воздуха под ее поверхностью. Смочите три листа хроматографической бумаги с гидроксидом натрия и положите их поверх папочной бумаги.
Удалите все пузырьки воздуха. Переверните второй мерный гель вверх дном и поместите его на хроматографическую бумагу. Смочите положительно заряженную нейлоновую мембрану деионизированной водой и поместите ее поверх геля.
Затем поместите на мембрану три хроматографических листа, смоченных деионизированной водой. Накройте любой открытый гидроксид натрия в контейнере полиэтиленовой пленкой, чтобы предотвратить испарение. Положите на кляксу стопку салфеток или бумажных полотенец высотой 0,3-0,5 метра.
Сожмите всю кляксу грузом, чтобы облегчить плотное действие капилляров, и оставьте на двое суток для переноса ДНК на мембрану.
