Для организации кинетического анализа на пептиды RBPR2 и STRA6 последовательно разбавляют мышиные RBPR2, мутантные пептиды RBPR2 и STRA6 в бегущем буфере. Откройте управляющее программное обеспечение и выберите мастер Kinetic SOAR Affinity. В диалоговом окне последовательности впрыска выберите Путь потока 2.1 с активной ячейкой потока 2 и ячейкой потока 1 в качестве опорной.
В диалоговом окне настройки отметьте опцию запуска циклов запуска, введите решение в качестве буфера, укажите количество циклов и нажмите кнопку Далее. Теперь перейдите в диалоговое окно с параметрами впрыска и введите параметры образца, такие как время контакта 120 секунд, скорость потока 30 микролитров в минуту и время диссоциации 300 секунд. Для параметров регенерации установите раствор регенерации на соляную кислоту глицина с временем контакта 30 секунд и скоростью потока 30 микролитров в минуту, затем нажмите далее.
В диалоговом окне образцов введите названия пептидов, молекулярную массу и концентрацию, затем нажмите «Далее». В диалоговом окне штатива распределите разведенные пептиды в виде отдельных образцов по 120 мкл с различными концентрациями от одного до 100 мкм в назначенные позиции на штативе. Нажмите на штатив для извлечения и вставьте все флаконы.
После этого нажмите «Далее», а затем в диалоговом окне «Подготовить протокол запуска» нажмите «Пуск». Введите имя файла и нажмите «Сохранить». Теперь в программном обеспечении нажмите меню «Пуск» и выберите оценку.
Откройте файл, затем в выпадающем меню выберите FC-2.1, чтобы проанализировать вычтенную активную сенсорную грамму из бланка эталонной ячейки на наличие фаз ассоциации и диссоциации пептидов msRBP4, мутантного msRBPR2 и msSTRA6. Затем нажмите на выпадающее меню кнопку Кинетика или Сходство и выберите Граница поверхности. В диалоговом окне выбора кривых отметьте галочкой столбец включения в таблице и нажмите кнопку Далее.
Теперь переходим в диалог выбора данных, просматриваем пустые вычитаемые сенсорные граммы. Нажмите «Кинетика и сходство». Сохраните параметры по умолчанию и нажмите кнопку «Подогнать» для подгонки кривой.
Проверьте вкладку отчета на наличие равновесной константы диссоциации Kd, скорости ассоциации Ka или Kon и скорости диссоциации Kd или Koff. Сохраните сенсорную диаграмму данных Kinetics в текстовой вкладке в ограниченном формате и используйте значения для построения графиков.
