Для начала энуклеируйте глазные шары усыпленной мыши и гомогенизируйте глаза в ледяном буфере. Центрифугируйте гомогенат при 16 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость, содержащую водорастворимые белки и другие загрязняющие вещества.
Затем ресуспендируйте и солюбилизируйте гранулированную мембрану и мембранные белки в буфере в течение одного часа при четырех градусах Цельсия на вращающейся платформе. После этого центрифугируйте растворимую мембранную фракцию в течение одного часа при температуре 16 000 G при четырех градусах Цельсия. Смешайте надосадочную жидкость с 30-50 микролитрами гранул антител Rho1D4 и незаполненными гранулами антител иммуноглобулина G в двух отдельных независимых образцах и инкубируйте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия на вращающейся платформе.
С помощью магнитной подставки отделите вытягивание, собрав бусины. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте шарики буфером с высоким и низким содержанием соли, содержащим пропан бис-трис, хлорид натрия и N-додецил-бета-D-мальтозид. Чтобы вымыть белок родопсина, инкубируйте шарики в течение 5-10 минут при комнатной температуре с буфером объемом 65 микролитров данного состава.
Затем с помощью прямоугольного субмикро кварцевого локтя объемом 50 микролитров с апертурой два миллиметра и длиной пути 10 миллиметров проанализируйте элюат на поглощение от 200 нанометров до 800 нанометров в условиях быстрого сканирования с помощью спектрофотометра. Чтобы проверить и определить качество, подвергните элюат воздействию яркого света в течение одной минуты. Затем повторите измерение поглощения.
Вычитаем поглощение холостого звука и вычисляем соотношение анализируемых спектров абсорбента. Затем построите график вычитания абсорбирующих спектров и рассчитайте значение свободного опсина. Затем, используя закон Беера-Ламберта, рассчитайте концентрацию родопсина, затем рассчитайте концентрацию безлигандного опсина и оцените разницу в концентрации апо-опсина и безлигандного опсина в количестве и процентном соотношении.
