Для начала сгенерируйте помеченные вирусом ассамблоиды, используя органоиды мозга, специфичные для судьбы. Для приготовления реагентов для предварительной обработки поверхности MEA растворите 0,5 грамма порошка фермента моющего средства в 50 миллилитрах деионизированной воды. Тщательно перебейте смесь в вихревом состоянии до полного растворения порошка и простерилизуйте раствор с помощью стерильного вакуумного фильтра в верхней части трубки внутри шкафа биобезопасности.
Разбавьте 500 микролитров 7% полиэтиленимина или стокового раствора PEI с 49,5 миллилитрами 1X боратного буфера для получения 0,07% раствора PEI. Чтобы стерилизовать раствор, отфильтруйте его через фильтрующий блок 0,22 микрометра внутри шкафа биобезопасности. Затем нанесите по одному миллилитру 1%-ного раствора фермента моющего средства в каждую лунку стерильной пластины MEA и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.
Затем удалите раствор моющего фермента из каждой лунки и промойте лунки пять раз 1,5 миллилитрами стерильной деионизированной воды на лунку. Заполните каждую лунку одним миллилитром питательной среды для предварительного кондиционирования. Поместите планшеты MEA обратно в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом на два дня.
После инкубации извлеките питательную среду из лунок и добавьте 50 микролитров 0,07%-ного раствора PEI для покрытия электродов MEA для первичного покрытия. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем полностью отсасывайте раствор PEI из каждой лунки.
Промойте каждую лунку три раза одним миллилитром стерильной деионизированной воды. После отсасывания воды просушите пластины при комнатной температуре в течение 15 минут в шкафу биобезопасности с открытой крышкой. Теперь покройте электродную область в каждой лунке 50 микролитрами от одного до 20 объемного объема матрицы базальной мембраны, разведенной в питательных средах для вторичного покрытия.
Поместите планшеты MEA обратно в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день отсадите разведенный матричный раствор, оставив тонкий слой на поверхности. Если образуется толстый слой, сильно распылите питательную среду на контактную область электрода с помощью наконечника для дозатора P1000.
Затем с помощью наконечника P1000 с широким разрезом соберите ассамблоид из чашки и аккуратно поместите его поверх электродов в лунку, перенося при этом как можно меньше сред. Поместите пластину под диссекционный микроскоп в ламинарный проточный колпак и с помощью стерильного наконечника Р 20 осторожно придвиньте ассамблоид в нужное место. Используйте наконечник P 20, чтобы удалить лишнюю жидкость вокруг сборки.
После инкубации извлеките пластину из инкубатора. Затем, наблюдая под микроскопом вскрытия, нанесите две-три небольшие капли от одного до 50 матрикса базальной мембраны, разведенной в питательных средах, поверх ассамблоидов и верните планшет в инкубатор еще на 30 минут. После этого осторожно добавьте три капли питательных сред рядом с ассамблоидами с помощью диссекционного микроскопа.
На следующий день проверьте, осели ли и стабилизировались ли ассамблоиды под микроскопом для вскрытия. Добавьте 750 микролитров питательных сред, чтобы довести общий объем до одного миллилитра на лунку, и оставьте тарелку в покое не менее чем на двое суток в инкубаторе. Каждую неделю тщательно удаляйте по 500 микролитров питательных сред из каждой лунки, а в каждую лунку вводите свежие 700 микролитров нейрофизиологических базальных сред.
Увеличение продолжительности разрыва сети наблюдалось на 92-й день по сравнению с 78-м днем, вероятно, из-за созревания нейронов. К 125-му дню активность сотовой и сетевой связи медленно угасла.
