Поддерживайте плюрипотентные стволовые клетки или ПСК в шестилуночных культуральных планшетах и подтверждайте плотность клеток под микроскопом. Для дифференцировки кардиомиоцитов или КМ засеивают ПСК в культуральный планшет с 96 лунками в среду для получения ПСК. На первой стадии кардиальной дифференцировки, когда ПСК достигают конфлюенции от 80 до 90%, переключите среду на среду дифференцировки КМ с 2-20 микромолярными CHIR.
Через 24–48 часов обработки CHIR смените среду на свежую среду для дифференцировки CM. На втором или третьем дне среду замените средой для дифференцировки КМ с добавлением пяти микромоляров IWR1 в культуре до пятого дня. Затем смените среду на среду для дифференцировки КМ и сохраняйте ее до шестого-седьмого дней, когда ПСК дифференцируются в сердечные клетки-предшественники, или КПК.
На 10-й или 12-й день зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. В момент окрашивания обработайте клетки проникающим раствором в течение 30 минут при комнатной температуре. Инкубируйте образец с первичным антителом CTNT в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.
Затем обработайте образец вторичными антителами в PBS, содержащими 1% бычьего сывороточного альбумина, в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. После удаления вторичного антитела из клеток окрашивайте ядра методом Хёхста в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем трижды промойте клетки с помощью PBS, прежде чем добавить 100 микролитров PBS на лунку, чтобы избежать высыхания.
Чтобы получить светлопольные и CTNT иммунофлуоресцентные изображения разных стадий дифференцировки с помощью автоматизированного микроскопа, поддерживающего культуру живых клеток, откройте программное обеспечение и создайте новый экспериментальный дизайн. Выберите объектив 5X и смешивание 2X2 для визуализации. В меню каналов добавьте канал яркого поля TL для светлого поля и каналы AF 488 и H 33 42 для иммунофлуоресцентной визуализации.
Измените путь света в настройках изображения. В меню Z stack задайте количество срезов и интервалов при сканировании. В окне навигации и тайлов настройте области тайлов по носителю и установите 25 тайлов по пять столбцов в пять рядов для одного колодца.
Для получения изображений сначала поместите планшет для клеточной культуры в лоток для образцов и загрузите лоток внутрь микроскопа. Если образец состоит из живых клеток, откройте систему нагрева и насос углекислого газа, чтобы поддерживать соответствующие условия для культивирования при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Откройте предустановленный экспериментальный проект.
Откройте меню плиток и откалибруйте положение плиты вручную. В окне навигации и тайлов выберите нужные колодцы и нажмите кнопку Создать, чтобы построить области мозаики для этих колодцев. Нажмите на кнопку Проверить области плитки в меню плиток и запустите автофокусировку, чтобы проверить все скважины.
Затем вручную корректируйте фокус каждой лунки. Нажмите кнопку «Начать эксперимент» и дождитесь автоматического создания образа. Как правило, сканирование целого 96-луночного планшета занимает около 1,2 часа.
В среде обработки выберите экспорт изображений, выберите тип файла в формате TIFF без сжатия или PNG и примените.
