Для начала покройте 24 луночные планшеты раствором для покрытия и инкубируйте в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия или в течение ночи при комнатной температуре. Дважды промойте пластины стерильной водой и храните их при комнатной температуре до тех пор, пока ячейки не будут готовы к покрытию. Теперь возьмите срез тощей кишки лошади и поместите его в холодный раствор на льду.
Извлеките 10-сантиметровую порцию из тощей кишки и откройте ее на границе с антибрыжеечкой, расположив нелимфоидные области в центре. Затем обрежьте часть примерно на семь на семь сантиметров и хорошо промойте ткань в свежем растворе перед вскрытием. Теперь приколите ткань на чашку Петри, покрытую силиконовым эластомером в растворе холодного кольца, или ПБС, слизистой стороной вверх, при этом максимально растягивая ее.
С помощью изогнутых щипцов удалите ворсинки кишечника, а затем удалите собственный слой пластинки примерно из нелимфоидной области размером пять на пять сантиметров. Далее ножницами для микрорассечения удалите подслизистую оболочку одним листом, освободив ее в одном углу. Наблюдайте за естественным отделением при отслаивании подслизистой оболочки от внутреннего кругового мышечного слоя.
Затем пропустите через мясорубку собранный подслизистый слой на две-пять миллиметровых кусочков. Поместите их в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую пять миллилитров оргоно без FBS, коллагеназы, протеазы и BSA. Инкубируйте ткань в течение двух-трех часов при температуре 37 градусов Цельсия для ферментативного пищеварения.
После инкубации добавьте 10 миллилитров оргоно комнатной температуры с FBS, чтобы остановить действие фермента. Пипетируйте тканевую смесь вверх и вниз 15 раз с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров, чтобы отделить клетки от ткани. Затем центрифугируйте смесь при 3000 G в течение трех минут при комнатной температуре.
После этого выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах PBS комнатной температуры, пипетируя раствор вверх и вниз 15 раз с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров. Центрифугируйте коническую пробирку при 3000 G в течение трех минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах комнатной температуры или с FBS путем пипетирования вверх и вниз 15 раз.
Затем последовательно отфильтруйте клетки через сетчатый фильтр размером пор 100 микрометров, 70 микрометров и 40 микрометров. После центрифугирования клеток и отбрасывания надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре оргоно с FBS. Затем окрашивайте клетки трипановым синим, чтобы выявить живые клетки и подсчитывать их с помощью гемоцитометра.
Теперь засейте примерно 400 000 клеток в 300 микролитров оргоно с FBS в каждую лунку 24-луночного планшета. Добавьте в каждую лунку пять микролитров N2, пять микролитров G5 и 10 микролитров B27. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы обеспечить адгезию клеток.
Когда клетки из первого прохода достигнут 70-80% конфлюенции, подвергните лунки воздействию нуля, 10 и 25 нанограммов интерлейкина-1 бета в течение 24 часов. В культурах наблюдались веретенообразные клетки, согласующиеся с энтеральной глиальной морфологией, с плеоморфизмом и минимальной контаминацией со стороны других типов клеток.
