Для начала обезвоживайте костно-остеохондральный эксплант, собранный от овец, в стеклянный флакон объемом 40 миллилитров, содержащий 25 миллилитров раствора для обезвоживания. Поместите флаконы на вращающееся колесо на один час при комнатной температуре. После последней стирки замените раствор для обезвоживания на 25 миллилитров ксилола.
Поместите стеклянные флаконы на вращающееся колесо на один час при комнатной температуре. Затем добавьте 10% пероксида бензоила, 10% дибутилфталата и 450 микролитров N, N-диметиланилина, разведенного от 1 до 20 в пропаноле, и поместите стеклянный флакон при температуре минус 20 градусов Цельсия на ночь. Теперь поместите эксплант в форму среднего размера для заделки в пластиковую коробку.
Залить в форму метилметакрилат бензоилпероксида, дибутилфталата N, N-анилиновый раствор. Проветрите форму с помощью потока азота в течение пяти минут. Герметично закройте коробку и поместите ее при температуре четыре градуса Цельсия на 48 часов для полимеризации и затвердевания ММА.
Через два дня извлеките из формы смолу, содержащую эксплант. Разрежьте блок полиметилметакрилата, содержащий эксплант, с помощью алмазной пилы вдоль его длинной оси, чтобы создать секцию толщиной 1,5 миллиметра со скоростью 3000 об/мин со скоростью три миллиметра в минуту. Отшлифуйте срез бумагой из карбида кремния с возрастающими числами.
Нанесите углеродное покрытие на толстый участок углеродной пленкой толщиной 10 нанометров. Закрепите секцию на алюминиевой заглушке. Затем создайте серебряный мостик между верхней частью секции и заглушкой, чтобы обеспечить эвакуацию заряда электронов на землю.
Поместите заглушку на столик для сканирующей электронной микроскопии, или СЭМ. Закройте камеру и запустите вакуум. Включите электронный луч и отрегулируйте настройки SEM для работы в режиме обратного рассеяния электронов.
Установите стандарты уровня серого на 25 для углерода, 225 для алюминия и 253 для кремния. После калибровки РЭМ с эталонами получить изображения образца в режиме обратного рассеяния электронов. Используйте изображение образца с обратным рассеянием электронов, чтобы преобразовать уровни серого в содержание кальция.
Затем построите график распределения кальция на изображении. Поместите секцию на столик рамановского микроспектрометра. Откалибруйте волновое число для обеспечения точности и выровняйте лазер перед измерением.
Для сбора спектров комбинационного рассеяния света используется 785-нанометровый лазер мощностью 30 милливатт. Установите время интегрирования равным 20 секундам, повторите три раза и используйте спектральный диапазон от 350 до 1 800 процентов с градацией 1 200 линий на миллиметр. После калибровки системы наноиндентирования поместите образец в оптическую систему и определите место для наноиндентирования.
Затем переместите образец под устройство для индентирования. Установите глубину вдавливания на 900 нанометров со скоростью загрузки-разгрузки 40 миллиметров в минуту и 15-секундной паузой между загрузкой и разгрузкой. Установите коэффициент косинуса для костной ткани равным 0,3 и начните наноиндентирование.
