Для начала поставьте на лед 50-миллилитровую трубку и последовательно добавляйте коллаген по одному раствору вместе с другими компонентами. Встряхните тюбик, чтобы тщательно перемешать. С помощью пипетки P10 добавьте один молярный раствор гидроксида натрия по каплям, встряхивая раствор смеси, чтобы довести pH до 7,3.
Добавьте 1,25 миллилитра матрицы базальной мембраны к пяти миллилитрам коллагеновой смеси и аккуратно перемешайте раствор. Затем поставьте на лед 12-луночную тарелку на две минуты. Используя наконечники с широким отверстием, медленно добавьте смесь коллагеновой одной базальной мембраны в 12-луночный планшет.
Поместите 12-луночный планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на два часа, чтобы первый слой гидрогеля застыл. Оставшийся коллаген храните на льду одну смесь базальной мембраны для последующего использования. Затем перенесите примерно 60 клеточных агрегатов в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.
И остудите трубку на льду в течение пяти минут. С помощью наконечника для дозатора P200 осторожно извлеките среду из пробирки. Добавьте 1,5 миллилитра коллагена в одну базальную мембрану по каплям к клеточным агрегатам и аккуратно перемешайте их с помощью наконечника пипетки P200 с широким отверстием для подвешивания.
Перенесите тарелку с первым слоем гидрогеля из инкубатора в шкаф биобезопасности. Добавьте 1,5 миллилитра суспензии заполнителя на отвержденный гидрогелевый слой и аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить агрегаты. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение двух часов.
Предварительно подогрейте среду для сосудистой дифференцировки два раза на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Добавьте два миллилитра среды в каждую лунку и культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Меняйте среду каждые три дня свежей предварительно подогретой средой для дифференцировки сосудов два.
Органоиды экспрессировали CD31, ERG1 и PDGFR бета, что указывает на присутствие сосудистых эндотелиальных клеток и паразитов. Сосудистые сети визуализировались с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии после очищения тканей. Зрелые органоиды, окрашенные на 17-й день, показали сосудистые сетки, инкапсулирующие сфероиды внутри гелевого блока.
Органоиды, полученные на 28-й день, имели сосудистые сетки, оборачивающиеся вокруг сфероидов, а не расширяющиеся радиально.
