Выделение и обработка цельной сетчатки для иммуноокрашивания ганглиозных клеток сетчатки мыши

После усыпления мыши с использованием шейного вывиха для энуклеации и обработки глазного яблока отметьте край роговицы на тыльной стороне глазного яблока синим маркером, чтобы обеспечить ориентацию во время рассечения. С помощью ножниц удалите остатки мышечных тканей, прикрепленных к глазному яблоку. Затем перенесите энуклеированное глазное яблоко в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку с круглым дном, заполненную PBS.

Теперь поместите глазное яблоко в другую двухмиллилитровую трубку, содержащую свежеприготовленный 4% параформальдегид для фиксации при температуре четыре градуса Цельсия на 10 минут. Под препарирующим микроскопом с помощью тонких щипцов сделайте небольшой разрез на роговице. Поместите глазное яблоко обратно в фиксатор и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех часов, чтобы сохранить морфологию ткани.

Чтобы удалить роговицу и хрусталик, с помощью тонких хирургических ножниц сделайте небольшой разрез примерно в один миллиметр вокруг лимба роговицы, границы между роговицей и склерой. Аккуратно разрежьте по окружности роговицы, иссекая ее полностью, чтобы обнажить нижележащие структуры. Далее с помощью тонких щипцов аккуратно захватите и осторожно приподнимите хрусталик из окружающих тканей, чтобы не повредить сетчатку.

Для разреза склеры вырежьте точный разрез в склере тонкими офтальмологическими ножницами, чтобы облегчить последующее рассечение. Далее для разделения сетчатки вставьте зубчатые щипцы в разрез между склерой и сетчаткой. Аккуратно возьмитесь за край склеры, избегая чрезмерной силы, чтобы не допустить разрыва ткани.

Постепенно увеличивайте разрез, перемещая щипцы вдоль границы между склерой и сетчаткой. Используйте зубную часть щипцов, чтобы аккуратно отделить склеру от сетчатки, не повреждая ее. Теперь с помощью острых ножниц разделите сетчатку на четыре примерно равных по размеру лоскута.

Аккуратно разверните рассеченную сетчатку щеткой с мягкой щетиной и тщательно удалите мусор с ее поверхности.