NIAID грант K22AI081748.

1. Биопленка Капельное проточном реакторе <ol><li> Биопленки капельного потока реактора (в продаже с Biosurface технологии или специально созданных версий обычно могут быть сделаны магазинов университета машины, см. Рисунок 1) собирается и в автоклаве. Ассамблея включает в себя проставление купоны в камерах и обеспечения крышки камеры. Камеры, а также биопленки среды (триптического бульон соевый 2 г / л и глюкозы 2 г / л) и влиятельных питательной трубки стерилизуют в автоклаве. </li><li> Прививка от реактора поток капельного предварительно поставив реактора на плоской поверхности, зажимая стоков линий трубки, заполняя каждую камеру с 10 мл соевого триптического бульон и добавить по 10 мкл С. золотистого культуры выращивали в течение ночи в триптического бульон сои. Прививку реактор затем поместите в 37 ° C инкубаторе в течение 18 часов. </li><li> После 18 часов инкубации стоков Трубы unclamped и реактор помещают на деревянный брусок, чтобы сократить угол 10 °. </li><li> Асептических условиях подключения влиятельных питательной трубки в бутылку, содержащую питательные бульоны непрерывного потока. Поток трубки линии, проходящей через насос и премьер труб путем запуска насоса при максимальной скорости (будет варьироваться в зависимости от модели насоса). </li><li> После влиятельных трубы заливают остановка насоса и приложить подключения иглы (22 калибра, 1 дюйм), чтобы в конце каждой трубки. Протрите пробку камеры входе с этанолом вытереть и асептически вставить иглы через входное отверстие пробкой. </li><li> Включите насос и дайте СМИ медленно капельно (расход ~ 125 мкл / мин) по сравнению с купонами. СМИ должны течь вниз по купону от входного отверстия пробкой, чтобы сточные воды портов. Эксплуатация реактора в непрерывный поток в течение 2-5 дней (в зависимости от приложения), иногда проверка реактора для надлежащего дренажа. </li><li> Для уборки капельного биопленки проточного реактора, остановки насоса и осторожно удалить иглы из реактора. Реактор может быть помещена на ровную поверхность и купоны могут быть стерильно удалить с помощью стерильного пинцета. Если микроскопия желательно, купоны могут теперь быть обработаны соответствующим образом (Рисунок 2B является сканирующая электронная микрофотография биопленки золотистого стафилококка, выращенные в реакторе биопленки капельно). Если количественная оценка биомассы биопленки или физиологии исследования Целью исследования, биопленки могут быть удалены из купон с помощью мобильного скребком. Удерживая купоны с пинцетом, осторожно очистить биопленки с купоном в коническую трубку с фосфатным буферным раствором с помощью мобильного скребком. Примечание: для количественного колониеобразующих единиц в биопленки, необходимо для гомогенизации собрано биопленки с тканью гомогенизатор разбить сгустки и формы однородная суспензия. Различные модели ткани гомогенизаторы подходят для данного применения. Мы используем Fisher Scientific Tissuemiser Гомогенизатор (продукт # 15-338-420) на полной скорости в течение 1 минуты до однородности биопленки образцов. Невыполнение гомогенизации биопленки приведет к недооценке колониеобразующих единиц присутствуют в образце. </li></ol> 2. Вращающийся диск Реактор биопленки <ol><li> Вращающийся диск реактора биопленки (доступно из имеющихся технологий из Biosurface или может быть заказ, см. рисунок 3) собирается и в автоклаве. Сборка реактора первое место вращающийся диск купоны в слоты вращающегося диска и размещения его в 1-литровый стеклянный стакан с переполнением порт. Номер 15-резиновой пробкой с отверстиями в ней, чтобы рабочие среды и аэрации используется в качестве реактора шапку. Реактор, биопленки СМИ (триптического бульон соевый 2 г / л и глюкозы 2 г / л), и впускной трубопровод, затем стерилизовать в автоклаве. </li><li> Вращающийся диск реактора биопленки засевают путем размещения 250 мл стерильной среды в реактор, и добавление 0,5 мл ночь С. золотистого культуры, выращенные в триптического бульон сои. Реактор помещается на мешалки установлена ​​в 250 оборотов в минуту и ​​инкубировали в течение ночи на желаемую температуру. </li><li> После 16 часов инкубации подключить входной трубопровод до порта на среднем пласте и подключить его к перистальтического насоса. Насос затем включите и поток установлен в ~ 0,25 мл / мин (поток может быть изменена в зависимости от темпов роста желательно). </li><li> Через 24 часа остановить реактор и асептически удалить диск, не касаясь биопленки купонов. Удалить купоны использованием стерильных щипцов и опустите каждый в фосфатным буферным солевым раствором, чтобы удалить какой-либо свободно прилагается бактерий. </li><li> Для антимикробной соединение, чипы могут быть помещены в отдельные лунки 96-луночного планшета содержащих соединений, представляющих интерес. После инкубации, чипсы, переводятся в 1,5 мл микроцентрифужных пробирки, содержащие 1 мл фосфатного буфера физиологического раствора и гомогенизировали ткани гомогенизатор для разгона нетронутыми биопленки. </li><li> Затем клетки серийный разбавляли и высевали на питательную среду агар для определения жизнеспособного колонии formiнг единиц. </li><li> Обратите внимание: многие изменения могут быть сделаны по вышеуказанным протоколом. Например, вращающийся диск купоны могут быть покрыты или сделаны из потенциальных анти-биопленки соединений для проверки эффективности. Биопленка диспергаторы также может быть оценена быть инкубации купоны в диспергирующих соединений и количественной бактерий прилагается против отключения. </li></ol> 3. Представитель Результаты Примером создана капельного реактора расход отображается, если рисунке 1. После трех дней поток обильное количество биопленки будет накапливаться на поверхности купон, на рисунке 2А. Общая биомасса будет варьироваться в зависимости от бактериальных штаммов и точные условия роста. Сканирующей электронной микрофотографии С. золотистого биопленки выращенных в реакторе потоком капельного показан на рисунке 2Б. Вращающегося диска реактора показана на рисунке 3А. Протокол, описанный могут быть адаптированы к специфическим требованиям вообще кто-либо микроорганизм, способный образовывать биопленки. Рис 3B показывает, вращающийся диск с 18 пластиковыми дисками прикреплена. Эти дисков выросли биопленки особенно хорошо подходят для антимикробной и урожайность очень воспроизводимые результаты 11. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Капельного потока реактора установки. Важные компоненты маркированы. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. Пример капельного потока С. золотистого биопленки. ) Это биопленки был выращен в течение трех дней после описанного протокола. Крышки от первых двух палат реактора удаляются, чтобы показать желтую С. биомассы золотистого биопленки. Б) Sacnning электронная микрофотография С. золотистого биопленки выращенных в реакторе потоком капельницу. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. Реактор вращающегося диска. ) Пример работы вращающийся реактор диска. Ключевой компонент помечены. Б) Крупным планом зрения вращающийся диск.

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+Biofilms.">Microbial Biofilms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li><li>Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms+in+nature+and+disease.">Bacterial biofilms in nature and disease.</a> Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple,+convergent+signaling+pathways:+a+genetic+analysis.">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).</li><li>Boles, B. R., Horswill, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agr-mediated+dispersal+of+Staphylococcus+aureus+biofilms.">Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms.</a> PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).</li><li>Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).</li><li>Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+cocktail+for+the+prevention+of+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+on+catheters+in+an+in+vitro+model+system.">Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).</li><li>Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Microbiology. 146, 547-549 (2000).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability.">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).</li><li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-generated+diversity+produces+"insurance+effects"+in+biofilm+communities.">Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).</li><li>Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+repeatable+laboratory+method+for+testing+the+efficacy+of+biocides+against+toilet+bowl+biofilms.">A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms.</a> J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).</li><li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+mediate+detachment+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+biofilms.">Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms.</a> Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).</li><li>Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function.">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).</li><li>Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+merocyanine+540+for+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cells.">Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Биопленки выращенных в различных реакторов будет часто имеют различные характеристики, и каждый реактор различных приложений. В этой работе мы описываем использование двух реакторов биопленки: биопленки капельного реактора потока и вращающегося диска реактора. Капельное реакторов ?...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Drip Flow Reactors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioSurface Technologies Corporation</td>
<td>DFR 110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotating Disk Reactors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioSurface Technologies Corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of drip flow and rotating disk reactors for staphylococcus aureus biofilm analysis

Большинство микробов в природе, как считается, существуют в качестве поверхностно-связанной общин в биопленки. 1 Бактериальные биопленки заключены в пределах матрицы и прикреплен к поверхности. 2 образование биопленки и развития, как правило, изучается в лаборатории с помощью пакетных систем, таких как микротитровальных пластин или потока системы, такие как поток-клеток. Эти методики полезны для скрининга мутантов и химических библиотек (микротитровальных пластин) 3 или выращивание биопленки для визуализации (поток клетки) 4. Здесь мы приведем подробные протоколы для выращивания золотистого стафилококка в двух дополнительных типов биопленки поток системы: биопленки капельного потока реактора и вращающийся диск реактора биопленки. Капельное реакторов поток биопленки предназначены для изучения биопленки, выращенных в условиях низкого сдвига. 5 реактор капельного потока состоит из четырех параллельных каналов теста, каждый из которых способен проведение одного стандартного стекла стекло микроскопа размера купона, или длина катетера или пребывания. Реактор капельного потока идеально подходит для микросенсора мониторинга, общих исследований биопленки, биопленки cryosectioning образцы, высокая производства биомассы, медицинская оценка материала, и пребывающего медицинское тестирование устройства. 6,7,8,9 Вращающегося диска реактора состоит из диска содержащие тефлон углублениями для съемных купонов. 10 съемных купоны могут по какой-либо из обрабатываемых материалов. В нижней части диска, вращающегося содержит магнитный стержень, чтобы вращения диска для создания жидкой поверхности сдвига по поверхности флеш-купонов. Весь диск, содержащий 18 купонам устанавливается в 1000 мл боковые стекла руке реактора. Жидких средах рост циркулирует через сосуд в то время как диск вращается с помощью магнитной мешалки. Купоны будут удалены из корпуса реактора, а затем соскабливают собирать биопленки образец для дальнейшего изучения или микроскопии изображений. Вращающийся диск реакторы предназначены для лабораторной оценки биоцида эффективности, удаление биопленки и производительность противообрастающих материалов. 9,11,12,13

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis at JoVE.com

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Протоколы для использования открытых биопленки проточной системе с реакторами капельного потока и вращающегося диска реакторов приведены в деталях.

Использование потоков для слива воды и вращающихся дисков для реакторов Золотистый стафилококк Биопленка Анализ

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

the-use-drip-flow-rotating-disk-reactors-for-staphylococcus-aureus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

17.0K Views.  University of Michigan. Протоколы для использования открытых биопленки проточной системе с реакторами капельного потока и вращающегося диска реакторов приведены в деталях.

Video: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Синегнойной палочки и Saccharomyces CEREVISIAE биопленки в Проточные ячейки

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

Подкожный Заражение метициллину Staphylococcus Aureus устойчивы (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

Экспериментальная модель Эндокардит метициллин устойчивый<em&gt; Золотистый стафилококк</em&gt; (MRSA) у крыс

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

Золотистый стафилококк рост использования человеческого гемоглобина в качестве источника железа

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

??????????? ??? ??? ??????????? ??????????????? ??????? ????????? ??? ????? I ?? V ? ??????????-??????????<em&gt; ?????????? ???????????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Изучение взаимодействий<em&gt; Золотистый стафилококк</em&gt; С нейтрофилами с помощью проточной цитометрии и микроскопии Длительная

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Ориентация биопленки Associated<em&gt; Стафилококк</em&gt; Использование ресазурин На основе лекарственной чувствительности анализа

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

генотипирование<em&gt; Стафилококк</em&gt; рибосомальным Spacer ПЦР (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

Методика изучения горизонтальных генного переноса в<em&gt; Стафилококк</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Характеристика человека Моноцит подмножеств по цельной крови Cytometry анализ потока

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...