Финансируемая Sigma-Aldrich

1. Обнаружение Mycoplasma <ol><li> Супернатантах клеточных культур можно проверить прямо или образец может подготовленные для использования на более поздний срок. Для подготовки для дальнейшего использования месте 100 мкл надосадочной в стерильную пробирку усиления и инкубировать при температуре 95 ° С в течение 5 минут. После завершения этого образца можно хранить при температуре 2-8 ° С не более одной недели. Просто перед запуском центрифуги образец кратко (5 секунд) для осаждения любой сотовой мусора. </li><li> Для подготовки образцов для ПЦР, определить общий объем Jumpstart Taq ДНК-полимеразы / регидратации буфера, который необходим для реакции. Мы будем готовить 5 всего реакций. Пять реакций потребует 2.5μl из Taq и 114.5μl регидратации буфера. Он будет содержать, как минимум, одну единицу Taq в реакцию и 22.5μl регидратации буфер на реакцию образца и отрицательного контроля плюс 24.5μl регидратации буфер для положительного контроля. 1 единица ДНК-полимеразы в реакции следует добавить соответствующий объем регидратации буфера. Это будет меняться с Taq используется. </li><li> Место расчетный объем ДНК-полимеразы Taq в чистую пробирку микроцентрифужных и следовать с расчетным объемом регидратации буфера. ДНК-полимеразы / регидратации буфера следует смешивать аккуратно, щелкая трубки. Эта смесь не следует перемешать. </li><li> Для подготовки отрицательного контроля и образцов использования прозрачных труб реакции представлены в комплекте. Реакция труб предусмотрено в комплекте уже содержат nuclueotides, грунтовки и внутренний контроль ДНК. 23 мкл Jumpstart Taq ДНК-полимераза / Регидратация буфера смеси, подготовленные на предыдущих этапах, должны быть размещены в каждом из отрицательного контроля и образцов труб. Добавить 2 мкл ДНК свободной воде отрицательного контроля и добавить 2 мкл образца к каждой из пробирок с образцами и этикетки. Перемешайте содержимое, щелкая труб. Содержание не следует перемешать. </li><li> Для подготовки положительного контроля используют розовый труб реакции представлены в комплекте. Реакция труб предусмотрено в комплекте уже содержат nuclueotides, грунтовки и внутренний контроль ДНК. Добавьте 25 мкл Jumpstart Taq ДНК-полимеразы / Регидратация буфера микс, подготовленный на предыдущих этапах, чтобы реакция труб и этикетки. Перемешайте содержимое, щелкая труб. Содержание не следует перемешать. Инкубируйте отрицательного контроля, положительного контроля и пробирок с образцами при комнатной температуре в течение 5 минут. </li><li> Для ПЦР состоится образцы должны быть помещены в термоциклер. При использовании JumpStart Taq активации шаг не требуется. Место реакции труб в термоциклер. Циклы должны быть установлены следующим образом: 94 ° С в течение 30 секунд, 55 ° С в течение 30 секунд и 72 ° С в течение 40 секунд. Эти циклы будут выполняться 40 раз. </li><li> После ПЦР циклов завершили образцы должны быть охлаждены до 4-8 ° С, удаляя их из термоциклер и размещения их в лед. Когда образцы охлаждением они должны быть загружены на агарозном геле для электрофореза. Загрузка геля и красителя не являются необходимыми, поскольку они уже присутствуют в реакционной трубы. Непосредственно нагрузки 8 мкл каждого ПЦР в отдельную полосу движения. Стоп-электрофореза после миграции на 2,5 - 3,0 см. </li></ol> 2. Представитель Результаты Отрицательный контроль должен показать полосы примерно 481 бп. Это можно увидеть в отрицательном колонки управления на гель-электрофореза, что показано в начале видео. Отсутствие отрицательной полосы контроля на 481 б.п. является хорошим показателем того, что активность полимеразы не sufficienttaq использовался недостаточно эффективны. Mycoplasma положительных проб покажет полосы в диапазоне 270 ± 8 б.п.. Полоса будет тяжелым для сильно загрязненных проб и слабый для слегка загрязненных образцов. Вариации интенсивности можно увидеть в положительном колоннами образца на гель-электрофореза, что показано в начале видео. Все образцы содержат внутренний отрицательный контроль, чтобы продемонстрировать, что ПЦР произошло, как ожидалось. Это нормально, чтобы увидеть отсутствие внутреннего контроля на сильно загрязненные образцы. Если нет полосы в положительном диапазоне или группы в отрицательном диапазоне на образец, это хороший показатель того, что ваши образцы запрещены. Если образец тормозится ПЦР ингибиторов могут быть удалены путем выполнения экстракции ДНК. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg" /> . Рисунок 1 Соответствующие полосы ампликона: Результаты обнаружения микоплазм методом ПЦР показаны. Переулок 2 является отрицательный контроль, который должен показать полосы примерно 481 бп. Отсутствие отрицательной полосы контроля на 481 б.п. является хорошим показателем того, что Taq использовался недостаточно эффективны. Mycoplasma-позитивных образцов покажет полосы в диапазоне 270 + 8 б.п., как показано на полосы 3 - 6. Полоса будет HEAиу для сильно загрязненных образцов (дорожка 6) и слабый для слегка загрязненных образцов (дорожка 4). Все образцы содержат внутренний отрицательный контроль (481 б.п.), чтобы продемонстрировать, что ПЦР произошло, как ожидалось. Это нормально, чтобы увидеть отсутствие внутреннего контроля на сильно загрязненные образцы.

<ol>
	<li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+(PCR)+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines.">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li><li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+(NAT).">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li><li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics:+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques.">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li></ol>

Авторы являются сотрудниками Sigma-Aldrich, что производится реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

Из-за повышенной чувствительности комплект, когда они выполняются правильно комплект должны дать точные результаты, показывающие, действительно ли ваш образец микоплазмы загрязнения. Комплект был оптимизирован для использования с JumpStart Taq ДНК-полимеразы. Другие taqs могут быть использованы при подготовке образцов, но внутренняя группа контроля на 481 б.п. должны присутствовать, чтобы указать правильный чувствительность альтернативных Taq. Вполне возможно, для положительного полосы проявлять различной плотности в зависимости от уровня загрязнения. Это можно наблюдать отсутствие внутреннего контроля группы на сильно загрязненных проб. Использование осторожности и правильной технике при подготовке образцов для предотвращения загрязнения имеют решающее значение для правильной. Обнаружение при использовании LookOut Mycoplasma ПЦР Kit.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии (необязательно) </th></tr><tr><td> LookOut Mycoplasma ПЦР Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> JumpStart Taq ДНК-полимераза </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> GenElute крови Геномная ДНК комплект </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> Nunc труб усиления </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

optimized pcr-based detection of mycoplasma

Обслуживание без загрязнения клеточных линий имеет важное значение для клеточных исследований. Среди крупнейших загрязнителей опасения микоплазмы загрязнения. Хотя микоплазмы обычно не убивают загрязненные клетки, их трудно обнаружить и может вызвать различные эффекты на культурах клеток, в том числе изменения метаболизма, замедление распространения и хромосомных аберраций. Короче говоря, микоплазмы загрязнения компромиссы стоимость этих клеточных линий в предоставлении точных данных для жизни научных исследований. Источников загрязнения микоплазмы в лабораторных условиях очень сложно полностью контролировать. Поскольку некоторые микоплазмы виды встречаются на коже человека, они могут быть введены из-за плохого асептики. Кроме того, они могут прийти из загрязненных добавки, такие как эмбриональной телячьей сыворотки, и, самое главное из других загрязненных клеточных культурах. Как только микоплазмы загрязняет культуре, он может быстро распространиться на загрязнять других областях лаборатории. Строгое соблюдение надлежащей лабораторной практики, такие как хорошая асептики являются ключевыми, и регулярное тестирование на микоплазму настоятельно рекомендуется для успешной борьбы с микоплазмой загрязнения. ПЦР-выявление микоплазмы стало очень популярным методом для текущего ремонта клеточной линии. ПЦР-методы обнаружения обладают высокой чувствительностью и может обеспечить быстрый результат, что позволяет исследователям быстро реагировать, чтобы изолировать и ликвидировать загрязнение, когда он будет обнаружен, по сравнению с Время, необходимое использованием микробиологических методов. LookOut Mycoplasma ПЦР Kit обладает высокой чувствительностью, с пределом обнаружения всего 2 геномов в мкл. Воспользовавшись весьма специфический JumpStart Taq ДНК-полимеразы и фирменным дизайном грунтовки, ложных срабатываний значительно снижается. Удобные 8-трубки формате, полоски предварительно покрытых дНТФ, и связанные с ними грунтовки позволяет увеличить пропускную способность удовлетворить потребности клиентов с большими коллекциями клеточных линий. Учитывая крайнюю чувствительность комплект, большое внимание должны быть приняты для предотвращения случайного загрязнения образцов и реагентов. Шаг за шагом мы демонстрируем протокол подчеркивает меры предосторожности и практики, необходимых для надежного обнаружения микоплазм. Мы также показываем, и обсудить типичные результаты и их интерпретация. Наша цель заключается в обеспечении успеха исследователей, использующих LookOut Mycoplasma ПЦР Kit.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma at JoVE.com

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

LookOut Mycoplasma ПЦР Kit используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая устанавливается как метод выбора при высокой чувствительности обнаружения микоплазма, Acholeplasma и Ureaplasma загрязнения в культурах клеток и других клеточных культур производным биологических препаратов.

Оптимизированная на основе ПЦР Выявление Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

optimized-pcr-based-detection-of-mycoplasma

Research

JoVE Journal

Biology

53.4K Views.  Sigma-Aldrich. LookOut Mycoplasma ПЦР Kit используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая устанавливается как метод выбора при высокой чувствительности обнаружения микоплазма, Acholeplasma и Ureaplasma загрязнения в культурах клеток и других клеточных культур производным биологическ?...

Video: Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Оптимизированная фибринового геля из бисера тест для изучения ангиогенеза

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Обнаружение белка убиквитинирования

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine parasitoids known to infect the host during the egg stage1. Second, it has a wide range of potential fruit fly hosts. Perhaps due to its life history, F. arisanus has been a successfully used for biological control of fruit flies in multiple tropical regions2-4. One impediment to the wide use of F. arisanus for fruit fly control is that it is difficult to establish a stable laboratory colony5-9. Despite this difficulty, in the 1990s USDA researchers developed a reliable method to maintain laboratory populations of F. arisanus10-12. There is significant interest in F. arisanus biology13,14, especially regarding its ability to colonize a wide variety of Tephritid hosts14-17; interest is especially driven by the alarming spread of Bactrocera fruit fly pests to new continents in the last decade18. Further research on F. arisanus and additional deployments of this species as a biological control agent will benefit from optimizations and improvements of rearing methods. In this protocol and associated video article we describe an optimized method for rearing F. arisanus based on a previously described approach12. The method we describe here allows rearing of F. arisanus in a small scale without the use of fruit, using materials available in tropical regions around the world and with relatively low manual labor requirements.

An Optimized Protocol for Rearing Fopius arisanus, a Parasitoid of Tephritid Fruit Flies

Fopius arisanus is an egg-larval parasitoid of Tephritid fruit flies that is successfully used in biological control of these important tropical pests. We describe here an optimized protocol for rearing F. arisanus on a small scale using readily available materials.

Оптимизированный протокол для разведения Fopius arisanus, Паразитоид из Tephritid плодовых мух

Fopius arisanus (Sonan) is an important parasitoid of Tephritid fruit flies for at least two reasons. First, it is the one of only three opiine ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Обнаружение модификации гистонов в листьях растений

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

ПЦР-метод генотипирования различать дикого типа и декоративных многообразия Императы цилиндрической</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Implantation of Electrospun Vascular Grafts with Optimized Structure in a Rat Model

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta replacement. The electrospun vascular grafts often possess relatively small pores, which limit cell infiltration into the grafts and hinder the regeneration and remodeling of the neo-arteries. In this study, PCL vascular grafts with thicker fibers (5 - 6 &#181;m) and larger pores (~30 &#181;m) were fabricated by using a modified processing technique. The long-term performance of the graft was evaluated by implantation in a rat abdominal aorta model. Ultrasound analysis showed that the grafts remained patent without aneurysm or stenosis occurring even after 12 months of implantation. Macroporous structure improved the cell ingrowth and thus promoted tissue regenerated at 3 months. More importantly, there was no sign of adverse remodeling, such as calcification within the graft wall after 12 months. Therefore, electrospun PCL vascular grafts with modified macroporous processing hold potential to be an artery substitute for long-term implantation.

Here, we present a modified electrospinning method to fabricate PCL vascular grafts with thick fibers and large pores, and describe a protocol to evaluate the in vivo performance in a rat model of abdominal aorta replacement.

Имплантация Electrospun сосудистых имплантатов с оптимизированной структурой в мышиной модели

Here, we present a protocol to fabricate macroporous PCL vascular graft and describe an evaluation protocol by using a rat model of abdominal aorta ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Here we describe a procedure to test the cell migration in vitro with an automated optical camera microscope. The scratch assay has been widely used where the closure of the scratch is followed for a set period. The optical microscope enables dependable and cheap detection of cell migration.

Оптимизированный скретч Assay в Vitro тестирования миграции клеток с автоматической оптической камеры

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

Простое обнаружение первичной силии с помощью иммунофлуоресценции

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic events in cell culture. To perform an unbiased, efficient identification and analysis of such events, a computer-vision based approach was developed and implemented in MATLAB. The analysis pipeline consists of a cell segmentation and exocytic-event identification algorithm. The computer-vision approach includes tools for investigating multiple parameters of single events, including the half-life of fluorescence decay and peak &#916;F/F, as well as whole-cell analysis of the frequency of exocytosis. These and other parameters of fusion are used in a classification approach to distinguish distinct fusion modes. Here a newly built GUI performs the analysis pipeline from start to finish. Further adaptation of Ripley&#39;s K function in R Studio is used to distinguish between clustered, dispersed, or random occurrence of fusion events in both space and time.

We developed automated computer vision software to detect exocytic events marked by pH-sensitive fluorescent probes. Here, we demonstrate the use of a graphical user interface and RStudio to detect fusion events, analyze and display spatiotemporal parameters of fusion, and classify events into distinct fusion modes.

Автоматизированное обнаружение и анализ экзоцитоза

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...