NIH гранты R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999

1. Подготовка <ol><li> Подготовка недавно решение сделаны Tyrodes &#39;(в мм, 128,2 NaCl, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 4 PO, 1,05 2 MgCl, 20,0 NaHCO 3, и 11,1 глюкозы). Для ускорения ежедневно приготовления растворов, подготовить два растворы заранее и хранить их при температуре +4 ° С холодильник: (1) Фото со я (в g/2L, 374,6 NaCl, 9,56 CaCl 2, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) и (2) Фото со II (в g/2L, 84,01 NaHCO 3). Для того, чтобы 2L решения Tyrodes &quot;достаточный для одного эксперимента принять 1840mL деионизированной воды и смешать в ней 80 мл на месте я, 80 мл на месте II, и 4 г глюкозы. </li><li> Подготовка исходных растворов красителей и разобщители: (1) возбуждение-сокращение разобщающий агент blebbistatin маточного раствора (Tocris Bioscience, 2mg/mL решение в ДМСО), (2) напряжение-чувствительных красителя ди-4-ANEPPS маточного раствора (Invitrogen, 1mg/mL раствор в ДМСО), (3) напряжение чувствительных красителей RH 237 маточного раствора (Invitrogen, 1.25mg/ml решение в ДМСО); (4) кальция индикатор Rhod-2 утра маточного раствора (Invitrogen, 1mg/ml решение в ДМСО). Одного эксперимента кролика требует примерно 30 мкл ди-4-ANEPPS маточный раствор, 30 мкл RH237 маточного раствора и 200 мкл Rhod-2 утра маточного раствора. Чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания, мы храним 100 мкл аликвоты ди-4-ANEPPS при температуре -20 ° C. Другие красители также хранятся при температуре -20 ° C. Магазин растворенного blebbistatin в холодильнике +4 ° C. </li><li> До уборки сердце, перекачки раствора Tyrodes &quot;в 2 л бутылки и поместите его в водяной бане (Fisher Scientific), который поддерживает температуру раствора при температуре 37 ° C. Решение кислородом с 95% O 2 - 5% СО 2. РН поддерживается на уровне 7,35 ± 0,05, регулируя уровень оксигенации. Решение распространяется в системе перфузии Langendorff и фильтруется нейлона чистый фильтр (размер пор: 11μm, Millipore), помещенные в перфузии линии до канюли. </li><li> Подготовка оборудования для мониторинга до уборки сердце. Датчик давления (WPI) используется для контроля аортального давления во время эксперимента. Базовый из датчика давления регулируется нулю мм рт.ст., когда сердце не прикреплен к перфузионной системы. Псевдо-ЭКГ электроды помещаются в камеру приблизить Ведущий I, II, III и из Эйнтховен треугольник ЭКГ. </li></ol> 2. Заготовка и перфузии сердца кролика <ol><li> Fix кролика кролика фиксатор. Эвтаназии кролика внутривенного введения натрия фенобарбитала (50 мг / кг) с 2000 гепарин U. Когда кролик полностью эвтаназии, которая определяется отсутствием боли рефлекс, грудной полости быстро открывается и сердце и легкие вырезали. </li><li> Сделайте разрез в верхней части восходящей аорты перед всеми ветвями дуги аорты. Промойте воздух из восходящей аорты, а затем быстро вводить иглу сердце 16 мм, канюля, которая была ранее подключенную к пузырь охотника, что очень важно для поддержания воздух из коронарных артерий. Как только сердце ретроградно перфузии не в рециркуляционной системе перфузии Langendorff, сделать разрез, чтобы открыть перикарда быстро. </li><li> Удалить легких, трахеи, жира и соединительной ткани, в то время как кровь смывается от перфузии. </li><li> Очень важно! Силиконовые трубки (~ 3 см в длину и 2 мм в диаметре) вводится через легочную вену и митральный клапан в левый желудочек (LV) и держат там в течение всего эксперимента. Эта трубка релизы решение, которое удерживается в LV. Без обращения в течение нескольких часов во время Langedorff-перфузионных эксперимент в механически иммобилизованных сердце, она, скорее всего, причиной тяжелой ишемии в полости ЛЖ и производить аритмии. </li><li> Перемещение сердца с канюлей для рециркуляции Langendorff-перфузионной системы с оптической аппаратуры отображения. </li></ol> 3. Проведение экспериментов с использованием Панорамный Оптические картографической системы <ol><li> Место в сердце на заказ шестиугольник камеры и подключить канюли для перфузии системы. Поддерживать аортального давления при температуре 60 ± 5 мм рт.ст., регулируя скорость потока перфузионного насоса. Монитор привести я псевдо-ЭКГ. Поддержание рН в пределах 7,35 ± 0,05. </li><li> Выключите комнате свет, потому что это blebbistatin photoinactivated УФ и нижний конец (450-490 нм), 17 из видимой части спектра. Медленно вводить blebbistatin маточного раствора через инъекции порт в воздухе пузырь охотника расположенный над канюли. Медленно вводят 0,1 мл на каждые blebbistatin болюсной инъекции. Подождите, пока давление стабилизироваться до следующей инъекции. </li><li> Аккуратно ходить электрод на место специфичные для вашего эксперимента. </li><li> Фокус изображения сердца в матовое стекло расположено на плоскости изображения каждого фотодиод массив (PDA) из трехравномерно расположенных углы вокруг сердца. Отрегулируйте положение канюли и расстояния между КПК и сердце, чтобы вписаться в сердце поля-обзора всех трех КПК. Возьмите картину каждого сфокусированное изображение в матовом стекле. </li><li> Медленно вводят 10 ~ 20 мкл ди-4-ANEPPS маточного раствора через инъекции порт в воздухе пузырь ловушка, в перфузии раствором. Подождите 1 ~ 3 минуты, прежде чем принимать оптические записи. </li><li> Для первой записи, включить зеленый цвет светодиода (без фильтра возбуждения, светодиодные FLOOD, Lumileds), возьмите оптические записи одновременно с трех КПК связано с заказной системой сбора данных, 5 и выключать светодиод. Проверьте качество сигналов от различных пикселях всех трех КПК. Добавить 0,1 ~ 0,2 мл blebbistatin маточного раствора, если артефакты движения в оптический потенциал действия заметили. Добавьте еще 5 мкл ди-4-ANEPPS маточного раствора, если сигнал-шум низкий. </li><li> Готово разработан экспериментальный протокол для функционального исследования. Повторное пятно сердца с дополнительными 5 мкл ди-4-ANEPPS маточного раствора, если сигнал ухудшается во время экспериментов из-за фотообесцвечивания или вымывания. </li><li> Включите комнате свет после завершения функциональные исследования. Сфотографируйте сердце из 36 равномерно распределенных точек зрения. Это достигается с помощью вращающихся сердца с шагом 10 ° с помощью цифровой камеры фиксируется на месте одного КПК. </li><li> Возьмите сердце из камеры. Слейте все решения. Вымойте перфузии системы в последовательности DI воды, 70% реагента алкоголя, и снова DI воды. </li><li> Анализ данных включает в себя реконструкцию сердцу геометрию из 36 цифровых фотографий, регистрации оптического сигнала на поверхность реконструированы геометрии, и количественная оценка длительности потенциала действия (АПД), скорости проведения (CV), фазы и т. д. 6 </li></ol> 4. Проведение экспериментов с использованием двойного картографической системы <ol><li> (Продолжить после часть 2) Место канюлированные сердца в камере стекла (Radnoti) и подключить канюли для перфузии системы. Придавить сердце кремния нижней камере при желудочковой вершины и предсердия. </li><li> Выключите комнате свет. Медленно вводить blebbistatin маточного раствора (15 ~ 20 минут до достижения 10 мкм) с помощью инъекции порта до перфузии канюли для иммобилизации сердце. </li><li> Положите пластиковой чашке Петри, или другое покрытие оконных стекол, выше эпикардиальных поверхность, чтобы уменьшить движение поверхности раствора. </li><li> Фокус два CMOS-камер в двойную систему отображения (Ultima-L, SciMedia) на одном поле зрения. Излучаемого флуоресценции отделяется дихроичных зеркала (635 отсечки, Омега оптический), и фильтруется 700 нм longpass фильтр (Thorlabs) для сигналов напряжения и 590/30 нм полосовой фильтр (Омега оптический) для кальция сигналов. </li><li> Цель световоды из двух галогеновых ламп (Newport Oriel Instruments, Стратфорде, штат Коннектикут; SciMedia, Коста Меса, Калифорния) в сторону отображение поля зрения, чтобы достичь еще освещения. Возбуждение фильтры (531/40 нм, SemRock) используются. </li><li> Пятно сердца с напряжением чувствительных красителей RH 237 маточного раствора (10 ~ 30 мкл) с помощью инъекции порт. </li><li> Смешайте Rhod-2 утра (0,2 мл) стандартного раствора с Pluronic F-127 (Invitrogen, 1:1 смеси). Разрушать ультразвуком в течение 1 мин в водяной бане sonicator. Inject смесь через порт пузырь охотника. Подождите примерно 20 минут, чтобы де-этерификации Rhod-2 утра до отображения начинается. </li><li> Для одной записи, выключите superfusion насос, чтобы избежать движения на поверхности раствора; включите источник возбуждающего света (галогенные лампы); принимать оптические записи на основе обеих камер, подключенных к системе сбора данных (Ultima-L, SciMedia) ; отключить возбуждающего света, а также включить superfusion насоса. Проверьте качество оптических сигналов. Повторная окраска тканей, если это необходимо. </li><li> Готово остальной разработан экспериментальный протокол для исследования. </li><li> Включите комнате свет и сфотографировать сердце, содержащей поле зрения. Возьмите сердце из камеры. Слейте все решения. Вымойте перфузии системы в последовательности DI воды, 70% реагента спирт (Fisher Scientific), Д. И. водой. </li><li> Анализ данных содержит измерений APD, CV, кальция переходных продолжительность (CaTD), задержка между AP движении вверх и CaT расти, время нарастания переходной кальция, а постоянная времени monoexponential приступе CaT распада. </li></ol> Представитель Результаты: <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig1.jpg" alt="Рисунок 1"/> Рисунок 1. Представителю результаты Langendorff-перфузии кроликов эксперимент с использованием панорамной оптической системы отображения. (А) спереди сердца кролика и реконструировано геометрии сердце кролика в виде трехмерной сетки сетки поверхности. (В) Тон развернул эпикардиальных поверхности цветные по фазе (полученные из анализа фазовой плоскости 18) с указанием волнового фронта отображается красным цветом во время эпизода тахиаритмия. (С) оптического потенциала действия записи из пяти местах вокруг фазовой сингулярности отмечен 1-5 в панели Б. (D) восемь снимков активации волнового фронта (красный цвет) распространения во время цикла стабильного повторно аритмией. Волнового фронта круги по часовой стрелке вокруг фазовой сингулярности, который виден на передней поверхности сердца. Цвет для реполяризации (синий) установлен быть частично прозрачными, так что задний фронт волны видимого (например, в 80 мс, 100 мс, 120 мс, а). Фильм об этой аритмии повторно представлена ​​в дополнительном видео 1. Методы геометрии реконструкции, регистрации сигналов, расчета фазовых карте, а поверхность развертки подробно описаны в другом месте 6. <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig2.jpg" alt="Рисунок 2"/> Рисунок 2. Представителю результаты Langendorff-перфузии сердца кролика эксперимент с использованием двойной системы отображения (одновременное отображение потенциала действия и кальция переходных). (А) передней поверхности сердца с отображением поля зрения покрыты черными точками. (B) крупным планом записей с одного сайта. (C) Образцы следы потенциала действия (синий) и кальция переходных (красный) из массива равномерно расположенных местах отмечены черными точками в примечании панели А., что не все записи пикселей показаны и пространственным разрешением 200 мкм.

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li><li>Panfilov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+heart+size+a+factor+in+ventricular+fibrillation?+Or+how+close+are+rabbit+and+human+hearts?.">Is heart size a factor in ventricular fibrillation? Or how close are rabbit and human hearts?.</a> Heart Rhythm. 3, 862-864 (2006).</li><li>Maier, L. S., Bers, D. M., Pieske, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+Ca(2+)-handling+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca(2+)-content+in+isolated+rat+and+rabbit+myocardium.">Differences in Ca(2+)-handling and sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-content in isolated rat and rabbit myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 32, 2249-2258 (2000).</li><li>Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+surface+reconstruction+and+fluorescent+visualization+of+cardiac+activation.">Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 47, 1382-1391 (2000).</li><li>Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+panoramic+imaging+of+cardiac+arrhythmias+in+rabbit+heart.">Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart.</a> J Biomed Opt. 12, 044019-044019 (2007).</li><li>Lou, Q., Ripplinger, C. M., Bayly, P. V., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity.">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li><li>Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+surface+reconstruction+and+panoramic+optical+mapping+of+large+hearts.">Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 1219-1229 (2004).</li><li>Li, W., Ripplinger, C. M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+monophasic+shocks+improve+electrotherapy+of+ventricular+tachycardia+in+a+rabbit+model+of+chronic+infarction.">Multiple monophasic shocks improve electrotherapy of ventricular tachycardia in a rabbit model of chronic infarction.</a> Heart Rhythm. 6, 1020-1027 (2009).</li><li>Ripplinger, C. M., Lou, Q., Li, W., Hadley, J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoramic+imaging+reveals+basic+mechanisms+of+induction+and+termination+of+ventricular+tachycardia+in+rabbit+heart+with+chronic+infarction:+implications+for+low-voltage+cardioversion.">Panoramic imaging reveals basic mechanisms of induction and termination of ventricular tachycardia in rabbit heart with chronic infarction: implications for low-voltage cardioversion.</a> Heart Rhythm. 6, 87-97 (2009).</li><li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+maps+of+intracellular+[Ca2+]i+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts+(abstract).">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts (abstract).</a> Circulation. 90, 632-632 (1994).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li><li>Fast, V. G., Ideker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+mapping+of+transmembrane+potential+and+intracellular+calcium+in+myocyte+cultures.">Simultaneous optical mapping of transmembrane potential and intracellular calcium in myocyte cultures.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 11, 547-556 (2000).</li><li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart.">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, 2053-2060 (2001).</li><li>Choi, B. R., Burton, F., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Ca2++triggers+early+afterdepolarizations+and+Torsade+de+Pointes+in+rabbit+hearts+with+type+2+long+QT+syndrome.">Cytosolic Ca2+ triggers early afterdepolarizations and Torsade de Pointes in rabbit hearts with type 2 long QT syndrome.</a> J Physiol. 543, 615-631 (2002).</li><li>Hwang, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+and+vulnerability+to+fibrillation+and+defibrillation+in+Langendorff-perfused+rabbit+ventricles.">Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles.</a> Circulation. 114, 2595-2603 (2006).</li><li>Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+susceptibility+to+alternans+in+a+rabbit+model+of+chronic+myocardial+infarction.">Enhanced susceptibility to alternans in a rabbit model of chronic myocardial infarction.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4527-4530 (2009).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+and+photoinactivation+of+blebbistatin+in+UV+and+visible+light.">Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light.</a> Biochem Biophys Res Commun. 320, 1020-1025 (2004).</li><li>Bray, M. A., Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+phase+plane+analysis+for+nonstationary+reentrant+cardiac+behavior.">Considerations in phase plane analysis for nonstationary reentrant cardiac behavior.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 65, 051902-05 (2002).</li><li>Fast, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+action+potentials+using+voltage-sensitive+dyes.">Recording action potentials using voltage-sensitive dyes.</a> Practical methods in cardiovascular research. , 233-255 (2005).</li><li>Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+voltage+changes+during+unipolar+stimulation+of+rabbit+ventricle.">Transmembrane voltage changes during unipolar stimulation of rabbit ventricle.</a> Circ Res. 77, 1229-1239 (1995).</li><li>Bishop, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+photon+scattering+in+optical+signal+distortion+during+arrhythmia+and+defibrillation.">The role of photon scattering in optical signal distortion during arrhythmia and defibrillation.</a> Biophys J. 93, 3714-3726 (2007).</li><li>Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+cardiac+pacemaker+circuits:+methodological+puzzles+of+the+sinoatrial+node+optical+mapping.">Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping.</a> Circ Res. 106, 255-271 (2010).</li><li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4, 619-626 (2007).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Основываясь на нашем опыте, ключи для успешной Langendorff-перфузии эксперимент сердце кролика включают хорошо подготовленный Tyrodes &quot;решение, быстрый урожай сердце, ухоженные перфузионного давления, а также соответствующие рН кислородом раствора в перфузионной системе. Для записи сигнала с максимально возможной сигнал-шум, мы должны рассмотреть факторы, включая источник света, оптические фильтры, фокусирующей оптикой, фотоприемников и т.д. 19. Подробная информация об этих аспектах, обсуждаются в другом месте 19. Молодые кролики (возраст: 4-5 месяцев, вес: 7-9 фунтов) могут быть использованы, чтобы избежать эпикардиальных жира, что снижает отношение сигнал-шум в оптических сигналов. Сигнал записан каждый пиксель представляет собой взвешенное интеграции излучаемого света от объема ткани. Глубина этой ткани объем зависит от возбуждения и излучения длиной волны красителя. Для ди-4-ANEPPS, как, например, оценкам глубина проникновения 300μm в сердца кролика 20. Таким образом, интерпретация оптического сигнала должно быть сделано с большой осторожностью, когда местные неоднородности электрических функции присутствуют в синусового узла, атриовентрикулярная узла, а во время желудочковой аритмии 1,21,22. Одним из ограничений оптической техники отображение по сравнению с электродом записи является то, что фазы реполяризации оптического потенциала действия часто distored движением артефакт вызван сердечного сокращения. Механические ограничения могут быть использованы для уменьшения артефактов, но не может полностью устранить его. Для сравнения, фармакологические возбуждение-сокращение разобщители эффективны в удалении движения артефакт. Однако эти разобщители (например, 2,3-бутандион Monoxime) может иметь значительные электрофизиологических побочных эффектов. Blebbistatin был продемонстрирован иметь никаких негативных побочных эффектов на сердечно электрофизиологии в нормальное сердце 23, и, таким образом, перспективным разобщающий агент для оптического отображения. Следует отметить, что ускорение отеков, вызванных отменой сокращение может также повлиять на электрофизиологии.

<table border="1"><tbody><tr><td> Реагент </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-глюкозы </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> Ди-4-ANEPPS </td><td> Invitrogen, Карлсбад, Калифорния </td><td> D1199 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Карлсбад, Калифорния </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-2 утра </td><td> Invitrogen, Карлсбад, Калифорния </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Карлсбад, Калифорния </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Диметилсульфоксид (ДМСО) </td><td> Sigma, Сент-Луис, Миссури </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

multiparametric optical mapping of the langendorff-perfused rabbit heart

Оптическое изображение и флуоресцентных зондов существенно передовые методологии исследования в области сердечной электрофизиологии способами, которые не могли быть выполнены другими приближается к 1. С помощью кальция и напряжения чувствительных красителей, оптические отображение позволяет измерять трансмембранных потенциалов действия и кальция переходные процессы с высоким пространственным разрешением без физического контакта с тканью. Это делает измерения электрической активности сердечной возможно при многих условиях, когда использование электродов неудобно или невозможно 1. Например, оптические записи предоставлять точную морфологические изменения мембранного потенциала во время и сразу после стимуляции и дефибрилляции, в то время как обычные методы электрода страдают от стимул-индуцированной артефакты во время и после стимулов из-за поляризации электродов 1. Langendorff-перфузии сердца кролика является одним из наиболее изученных моделей человеческой физиологии и патофизиологии сердца. Многие виды аритмии наблюдались клинически могут быть обобщены в модели сердца кролика. Было показано, что волновые паттерны в сердца кролика при желудочковой аритмии, определяется эффективный размер сердца и длины волны спускаемого, очень похожи на том, что в человеческом сердце 2. Было также показано, что критические аспекты возбуждения-сжатия (ЕС) связи в миокарде кролика, такие как относительный вклад саркоплазматического ретикулума (СР), очень похожи на человеческие связи ЕС 3. Здесь мы приводим основные процедуры оптических экспериментов отображение в Langendorff-перфузии сердца кролика, в том числе системы Langendorff перфузии установки, оптические картографические системы установки, изоляции и катетеризации сердца, перфузии и красителя окрашивание сердца, возбуждение-сокращение расстыковки и сбор оптических сигналов. Эти методы могут быть также применены к сердцу от видов, кроме кролика с корректировкой расхода, оптика, растворов и др. Два оптических систем отображения описаны. Панорамная система отображения используется для отображения всей эпикарда из сердца кролика 4-7. Эта система обеспечивает глобальный взгляд на эволюцию возвратных схем во время arrhythmogenesis и дефибрилляции, и был использован для изучения механизмов развития аритмий и antiarrhythmia терапии 8,9. Двойная система отображения используется для сопоставления потенциала действия (AP) и кальция переходных (КПП) одновременно с того же поля зрения 10-13. Такой подход расширил наше понимание важной роли кальция в электрических альтернации и индукции аритмии 14-16.

Watch this Scientific Journal Video about Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart at JoVE.com

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

В этой статье описаны основные процедуры проведения оптических экспериментов отображение в Langendorff-перфузии сердца кролика использованием панорамной системы визуализации, а также двойное (напряжение и кальция) изображения модальности.

Многопараметрический Оптический Картирование Langendorff-перфузии сердца кролика

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

multiparametric-optical-mapping-langendorff-perfused-rabbit

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.4K Views.  Washington University in St. Louis. В этой статье описаны основные процедуры проведения оптических экспериментов отображение в Langendorff-перфузии сердца кролика использованием панорамной системы визуализации, а также двойное (напряжение и кальция) изображения модальности.

Video: Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Оптические карты потенциалов действия и кальция Переходные процессы в сердце мыши

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Cre-LOX P Рекомбинация подход для обнаружения сотовых Fusion В Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

В пробирке Синтез Родные, волокнистых длинные интервалы и Сегментные Длинные Коллаген Расстояние

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specific simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered by the absence of in vivo imaging technology for clinically acquiring myocardial fiber orientations. The objective of this project was to develop a methodology to estimate cardiac fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries. An accurate representation of ventricular geometry and fiber orientations was reconstructed, respectively, from high-resolution ex vivo structural magnetic resonance (MR) and diffusion tensor (DT) MR images of a normal human heart, referred to as the atlas. Ventricular geometry of a patient heart was extracted, via semiautomatic segmentation, from an in vivo computed tomography (CT) image. Using image transformation algorithms, the atlas ventricular geometry was deformed to match that of the patient. Finally, the deformation field was applied to the atlas fiber orientations to obtain an estimate of patient fiber orientations. The accuracy of the fiber estimates was assessed using six normal and three failing canine hearts. The mean absolute difference between inclination angles of acquired and estimated fiber orientations was 15.4 &deg;. Computational simulations of ventricular activation maps and pseudo-ECGs in sinus rhythm and ventricular tachycardia indicated that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.The new insights obtained from the project will pave the way for the development of patient-specific models of the heart that can aid physicians in personalized diagnosis and decisions regarding electrophysiological interventions.

A methodology to estimate ventricular fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries for personalized modeling is described. Validation of the methodology performed using normal and failing canine hearts demonstrate that that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.

Пациент конкретного моделирования сердца: оценка ориентации волокон Желудочковая

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Оптический Обнаружение<em&gt; Е. палочка</em&gt; Бактерии по Мезопористые Silicon биосенсоров

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Наноманипулирование Единого РНК молекул на оптический пинцет

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

В Ситу отображение механических свойств биопленок частицей отслеживания микрореология

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Внутрипротокового Доставка в Кролика МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Свет лист флуоресцентной микроскопии для изучения мышиных сердца

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Двухосная механические характеристики Предсердно-желудочковые клапаны

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...