Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Джей Pepose за помощь в обучении модели нам. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья грантов EY11885 (ПМС), EY21247 (PMS) и неограниченный грант от исследований в области профилактики слепоты в отделение офтальмологии.

Примечание уходу за животными: Анальгетики не используются в данной модели, поскольку они являются противовоспалительными и таким образом не повлияет на модель. 1. Подготовка Вирус <ol><li> Расти HSV-1 на клетках Веро (80% вырожденная) с использованием начиная разбавления 0,01 множественности инфекции (в Т-150 колбы, примерно 5 х 10 5 бляшкообразующих единиц) в течение 3-4 дней, пока все клетки округло-до и легко смещаются, нажав колбу. </li><li> Удалить СМИ стерильные пробирки и центрифуги Sorvall Legend RT при температуре 4 ° C и 3500 оборотов в минуту в течение 15 мин. После удаления супернатанта (см. п. 1.3), ресуспендируют большой осадок от каждой трубки 50 мл с 5 мл от общего числа средств массовой информации. Разрушать ультразвуком в течение 1 минуты в двух 30-всплесков сек. </li><li> Удалите супернатант и введен в 50 мл стерильной Oak Ridge труб и центрифуге при 9000 оборотах в минуту, в течение 1 часа при температуре 4 ° С в Beckman J2-21 центрифуг. Это для производства небольших вирусных гранул. Удалите супернатант. </li><li> Комбинат разрушать ультразвуком от 1,2 остроумиеч гранул от 1,3 и разрушать ультразвуком раз в течение 45 сек. Центрифуга Sorvall Legend в РТ на 1500 оборотах в минуту в течение 5 мин при 4 ° C. Сохранить супернатант. Это является вирус акции которых аликвоты и хранили при температуре -70 ° C. </li><li> Титр вируса на клетках Vero. Я обычно пластина из 10 0 до 10 -8 разбавления (каждая из которых в 10-кратном разведении) 2x от 2 отдельные наборы разведения. Титрование вируса выполняется на 12-и стерильные чашки. </li></ol> 2. Мышь инфекции <ol><li> Вводите каждую мышь с 0,1 мл анестетика cocktail/20 г массы тела мыши (кетамин, 60 мг / кг + Ксилазин 5 мг / кг, разводят в HBSS). Этот коктейль используется потому, что он является одним из самых безопасных средств анестезии при надлежащей дозировке используется и эффект этого препарата очень недолго. </li><li> Когда мышам под наркозом поцарапать роговицу правого глаза с 30 иглой использованием рассекает микроскопом, чтобы убедиться, что роговица не перфорированные. </li><li> Каждая мышь Received внутрибрюшинного введения 1 мл объединенной человеческой сыворотки (Sigma, Темекула, Калифорния; анти-HSV реактивности с эффективной дозы для 50% вирусных нейтрализации 1:800) для того, чтобы защитить роговицу от повреждений во время первичной инфекции. </li><li> Количество мышей с другом ухе клипы или на слух удар. </li><li> После того как все мыши были пронумерованы, используя 20 мкл пипетки, мы заразить каждого глаза с 10 6 PFU (5 мкл). Мы заражать только один глаз и, как правило правый глаз. Мы также разместить 5 мкл HBSS на другой глаз, чтобы держать его влажным, пока они находятся под наркозом. 5 мкл является достаточным для поддержания гидратации глаза, так как процедуры выполняются менее чем за 10 мин, а животным вводили анестетик соответственно. Инфекция подтверждена моечные мышей 3 дня после инфицирования стерильного аппликатора хлопка, который был гидратированных в 1 мл Vero СМИ. Затем 100 мкл добавляют в Vero клеток, выращенных в 48-луночных планшетах. Эти плиты мониторинга ежедневно в течение цитопатического эффекта<html> (CPE). </li></ol> 3. Возобновление мышей от Задержка <ol><li> Мышей анестезируют по крайней мере 5 недель после первичной инфекции. Следует отметить, что мы возобновлена ​​мышей до одного года следующим первичной инфекции и не наблюдается существенных различий в ответе. </li><li> После наркоза они находятся TM20 хромато-Vu трансиллюминатор, который излучает УФ-Б на пике волны 302 нм, так что только один глаз подвергается воздействию УФ-B света. Каждая мышь подвергается 250 мДж УФ-В свете см 2. </li><li> Возобновление определяется путем взятия мазка глаз с аппликатором стерильной хлопковой, что сначала помещают в 1 мл Vero СМИ в день 0 (перед УФ-В экспозицию для контроля спонтанных Тримминги), а затем в дни с 1 по 7 пост-UV-B облучения. Материал тампона оценивается как описано в 2,5). Для тех, тампоны, которые имеют инфекционный вирус количество вируса хихикали от стандартного анализа налета с использованием 12-луночных планшетах. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. Клиническая оценка <ol><li> Мыши оценивают по клиническим заболеванием глаз в маске наблюдателя помощью бинокулярного микроскопа рассекает. </li><li> Помутнение роговицы оценивается по шкале от 0 до 4, где 0 означает ясный стромы, 1 указывает на мягкое стромальные помутнения, 2 указывает на умеренную прозрачность, заметные особенности радужки, 3 указывает на плотную прозрачность с потерей определены подробно радужной оболочки, кроме ученика поля, а 4 указывает, общая непрозрачность, без заднего вида. </li><li> Неоваскуляризации оценивается по шкале от 1 до 8 путем деления роговицы на 4 равных квадранта и определения степени васкуляризации в каждом из этих секторов. </li><li> Блефарит измеряется следующим образом: 0, без повреждений, 1, минимальный отек век, 2, умеренный отек и твердые глазные разряда, 3, сильный отек, умеренная периокулярной выпадение волос и кожи поражений и 4, тяжелые отеки с глаз коркой замке, тяжелые периокулярной выпадение волос, кожи и поражения. </li><li> Свидетельство энцефалита включенийДед сутулая спина, взъерошенные волосы, и очевидные неврологические нарушения. Мыши эвтаназии, когда они обнаруживают существенные признаки энцефалита. </li></ol> 5. Представитель Результаты Очередная модель, которая была описана выше, был впервые опубликован Shimeld, и др.. 1-3. Они протестированы и наша лаборатория использует модифицированную версию этой модели, чтобы опубликовать много рукописей на протяжении многих лет 4-15. Эта модель была использована для определения той роли, которую цитокинов интерферона-γ играет в периодических HSV-1 заболевания 10. Как показано на рисунке 3, мышей, лишенных IFN-дисплее хуже заболеваниями роговицы, чем у мышей дикого типа 14. Было также успешно использоваться для определения терапевтической ценности различных вакцин строит 6,10,11. Обратите внимание, что в одном случае вакцины испытаны работал хорошо профилактически, но не оказаться терапевтически эффективные 6. Тем не менее,При репликации вирусной вакцины некомпетентность была протестирована, она была не только эффективной профилактической, но был также очень эффективным терапевтически 10,11 см. Рисунок 5 в ссылке 10. Совсем недавно мы использовали эту модель, чтобы определить, гендерные различия были обнаружены у мышей проходят периодические HSK. Как показано на рисунке 1 показано, самцов мышей C57BL / 6 отображать значительно меньше, помутнение роговицы, чем женщины C57BL / 6 мышей. Аналогичным образом, когда неоваскуляризации роговицы оценивали, самцы мышей продемонстрировали значительно меньше новое судно роста в роговице, чем самок мышей (рис. 2). Сейчас мы тестируем ли этот фенотип штамма конкретного, выполняя аналогичный анализ в других линий мышей. Мы также определить, является ли различие связано с отсутствием тестостерона или присутствие эстрогенов. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig1.jpg" /> Рисунок 1. Заболеваниями роговицы в мужской и женской C57BL / 6 линий мышей после UV-B индуцированной активации. Латентно инфицированных мышей вынуждена возобновить с UV-B облучения и мышей наблюдали в течение помутнение роговицы в течение 35 дней. Число мышей, используемых для этих исследований были следующие: мужчины, п = 15; женщин, п = 15. Результаты показывают среднее ± SEM. * Был значительно больше, вирус-индуцированного заболевания у самок мышей C57BL / 6 дней 14-35 (р = 0,001 до 0,01). <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig2.jpg" /> Рисунок 2. Заболевания роговицы в мужской и женской C57BL / 6 линий мышей после UV-B индуцированной активации. Латентно инфицированных мышей вынуждена возобновить с UV-B облучения и мышей наблюдали в течение неоваскуляризации роговицы в течение 35 дней. Число мышей, используемых для этих исследований были следующие: мужчины, п= 15; женщин, п = 15. Результаты показывают среднее ± SEM. * Был значительно больше, вирус-индуцированного заболевания у самок мышей C57BL / 6 дней 14-28 (р = 0,001 до 0,01).

<ol>
	<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+model+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice.">An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).</li><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+latent+infection+and+induction+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice.">Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).</li><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+immunization+protects+the+mouse+eye+from+damage+after+herpes+simplex+virus+infection+by+limiting+spread+of+virus+in+the+nervous+system.">Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system.</a> J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).</li><li>Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+murine+model+of+recurrent+herpes+simplex+viral+keratitis+induced+by+ultraviolet+B+radiation.">Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).</li><li>Keadle, T. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+ameliorates+corneal+disease+in+a+mouse+model+of+recurrent+herpetic+keratitis.">IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis.</a> Microbial Path. 38, 13-21 (2005).</li><li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+recombinant+glycoprotein+D+subunit+vaccine+on+the+development+of+primary+and+recurrent+ocular+infection+with+herpes+simplex+virus+type+1+in+mice.">Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice.</a> J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).</li><li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines+IL-1+and+TNF-a+are+required+for+recurrent+herpetic+keratitis+in+NIH+mice.">Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).</li><li>Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+cytokine+expression+in+a+murine+model+recurrent+herpetic+stromal+keratitis.">Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).</li><li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++and+CD8++cells+are+key+participants+in+the+development+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice.">CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> Microbial Path. 32, 255-262 (2002).</li><li>Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+immunization+with+a+virion+host+shutoff-defective,+replication-incompetent+herpes+simplex+virus+type+1+strain+limits+recurrent+herpetic+ocular+infection.">Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection.</a> J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).</li><li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+vaccination+with+vhs(-)+herpes+simplex+virus+reduces+the+severity+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice.">Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).</li><li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aminoguanidine+on+primary+and+recurrent+ocular+herpes+simplex+virus+infection.">The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection.</a> Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).</li><li>Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL3+protects+mice+from+corneal+pathology+during+recurrent+HSV-1+infection.">CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection.</a> Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).</li><li>Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+is+not+required+for+recurrent+herpetic+stromal+keratitis.">Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Virology. 380, 46-51 (2008).</li><li>Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Interferon-gamma+by+an+adenovirus+vector+blocks+herpes+simplex+virus+Type+1+reactivation+in+vitro+and+in+vivo+independent+of+RNase+L+and+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+pathways.">Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways.</a> J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Очередная модель герпетического кератита стромальных (HSK), описанные здесь, позволяет следователю для изучения человеческих HSK в модели, которая в большей степени соответствует тому, что наблюдается при болезни человека. Таким образом, сильные модели в том, что заболевание возникает в ?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/ Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15290018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>Legend RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>52-21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transilluminatior</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0452-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicatior</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Sonifier 450</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>Z 720410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks- 7150</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates- 12 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS 3513</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates- 48 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS 3548</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Conical Tubes- 30 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS 430828</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needles</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309602</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent herpetic stromal keratitis in mice, a model for studying human hsk

Герпетическая болезнь глаз, называемый герпетический кератит стромальных (HSK), является потенциально ослепительно инфекции роговицы, что приводит к более 300.000 клинических посещений каждый год на лечение. От 1 до 2 процентов пациентов с клиническим заболеванием будет испытывать потерю зрения зараженных роговицы. Подавляющее большинство этих случаев являются результатом реактивации латентной инфекции простого герпеса первого типа вируса, а не в связи с острым заболеванием. Интересно, что острой инфекции является модель наиболее часто используется для изучения этого заболевания. Тем не менее, было отмечено, что периодически модели HSK бы лучше отражают то, что происходит во время клинической картины заболевания. Очередная животных моделей для HSK использовали как кроликов и мышей. Преимущество кроликов является то, что они испытывают реактивации с задержкой в ​​отсутствие какого-либо известного стимула. Тем не менее, трудно изучить роль, что многие иммунологические факторы играют в периодических HSK потому что кролик модель не имеет иммунгические и генетические ресурсы, что мышь имеет. Мы решили использовать модель мыши для повторного HSK потому что она имеет то преимущество, существует много ресурсов, а также мы знаем, когда возобновление будет происходить, потому что реактивация индуцируется под воздействием UV-B света. До сих пор эта модель позволила тех лабораторий, использующих его для определения нескольких иммунологических факторов, которые важны для этой болезни. Это также позволило нам проверить, как терапевтический и эффективности вакцины.

Watch this Scientific Journal Video about Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK at JoVE.com

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Большинство исследований герпетические заболевания роговицы использовать основной модели инфекции. Тем не менее, первичной инфекции ВПГ-1, как правило, не приводят к болезни человека. Здесь мы опишем периодически модели герпетического заболевания роговицы, которые более точно имитирует человеческую болезнь.

Рецидивирующей герпетической Стромальные Кератит у мышей, модель для изучения человека HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

recurrent-herpetic-stromal-keratitis-mice-model-for-studying-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Views.  Saint Louis University. Большинство исследований герпетические заболевания роговицы использовать основной модели инфекции. Тем не менее, первичной инфекции ВПГ-1, как правило, не приводят к болезни человека. Здесь мы опишем периодически модели герпетического заболевания роговицы, ...

Video: Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: изучение патогенности и Хост Взносы в инфекционным колитом

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения гетерогенности человека дифференциации макрофагов и поляризация

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

Комплексное 4D визуализация<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Инфекции у мышей

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Выделение Мышиный лимфатических узлов стромальных клеток

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways activated during cardiovascular pathologies are, however, limited by the lack of robust and physiologically relevant methods. In order to model pathological vascular events we have developed an in vitro assay for studying the interaction between endothelium and whole blood. The assay consists of primary human endothelial cells, which are placed in contact with human whole blood. The method utilizes native blood with no or very little anticoagulant, enabling study of delicate interactions between molecular and cellular components present in a blood vessel.
We investigated functionality of the assay by comparing activation of coagulation by different blood volumes incubated with or without human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Whereas a larger blood volume contributed to an increase in the formation of thrombin antithrombin (TAT) complexes, presence of HUVEC resulted in reduced activation of coagulation. Furthermore, we applied image analysis of leukocyte attachment to HUVEC stimulated with tumor necrosis factor (TNF&#945;) and found the presence of CD16+ cells to be significantly higher on TNF&#945; stimulated cells as compared to unstimulated cells after blood contact. In conclusion, the assay may be applied to study vascular pathologies, where interactions between the endothelium and the blood compartment are perturbed.

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Роман<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Экспериментальная Заражение<em&gt; листерий</em&gt; В качестве модели для изучения хоста интерферон гамма ответов

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Методологии для изучения<em&gt; B. Сенная</em&gt; биопленки в качестве модели для Характеризуя Molecule биопленки Small ИНГИБИТОРЫ

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Анализ 18FDG ПЭТ/КТ изображений как инструмент для обучения микобактерии инфекции и лечение в Non-human приматов

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Implantation and Monitoring by PET/CT of an Orthotopic Model of Human Pleural Mesothelioma in Athymic Mice

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. MPM development is mainly associated with asbestos. Treatments provide only modest survival since the median survival average is 9&#8211;18 months from the time of diagnosis. Therefore, more effective treatments must be identified. Most data describing new therapeutic targets were obtained from in vitro experiments and need to be validated in reliable in vivo preclinical models. This article describes one such reliable MPM orthotopic model obtained after injection of a human MPM cell line H2052/484 into the pleural cavity of immunodeficient athymic mice. Transplantation in the orthotopic site allows studying the progression of tumor in the natural in vivo environment. Positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) molecular imaging using the clinical [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose ([18F]FDG) radiotracer is the diagnosis method of choice for examining patients with MPM. Accordingly, [18F]FDG-PET/CT was used to longitudinally monitor the disease progression of the H2052/484 orthotopic model. This technique has a high 3R potential (Reduce the number of animals, Refine to lessen pain and discomfort, and Replace animal experimentation with alternatives) since the tumor development can be monitored non-invasively and the number of animals required could be significantly reduced.
This model displays a high development rate, a rapid tumor growth, is cost-efficient and allows for rapid clinical translation. By using this orthotopic xenograft MPM model, researchers can assess biological responses of a reliable MPM model following therapeutic interventions.

This article describes the generation of an orthotopic mouse model of human pleural mesothelioma by implantation of H2052/484 mesothelioma cells into the pleural cavity of immunocompromised athymic mice. The longitudinal monitoring of the development of intrapleural tumors was assessed by non-invasive multimodal [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography imaging.

Имплантация и мониторинг ПЭТ/КТ ортотопической модели плевральной мезотелиомы человека у атимических мышей

Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare and aggressive tumor arising in the mesothelium that covers the lungs, the heart, and the thoracic cavity. ...