Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jay Pepose para ajudar ensinando o modelo para nós. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants EY11885 (SPM), EY21247 (SPM) e uma concessão irrestrita de Pesquisa para prevenir a cegueira para o Departamento de Oftalmologia.

Nota Animal Care: Analgésicos não são utilizadas neste modelo uma vez que são anti-inflamatórios e, assim, invalidar o modelo. 1. Preparação de Vírus <ol><li> Crescer HSV-1 em células Vero (80% confluentes) utilizando uma diluição de partida de 0,01 multiplicidade de infecção (em balão T-150, cerca de 5 x 10 5 unidades formadoras de placa) durante 3-4 dias até que todas as células foram arredondados para cima e são facilmente retirados por bater o frasco. </li><li> Remova a mídia para tubos de centrífuga estéreis, e centrifugar na Sorvall Legend RT a 4 ° C e 3500 rpm durante 15 min. Depois de remover o sobrenadante (ver 1.3), ressuspender pellet grande de cada tubo de 50 ml com 5 ml de meios totais. Sonicar durante 1 min em dois bursts 30 seg. </li><li> Remover o sobrenadante e colocados em tubos de 50 ml estéreis, Oak Ridge e centrifugar a 9000 rpm, durante 1 hora a 4 ° C numa centrífuga Beckman J2-21. Isto é para produzir um sedimento pequeno viral. Descartar o sobrenadante. </li><li> Combine sonicate de 1,2 sagacidadeh pellet de 1,3 e sonicar novamente por 45 segundos. Centrífuga Sorvall Legend em RT a 1.500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Salve o sobrenadante. Esta constitui a reserva de vírus, que é dividido em alíquotas e armazenado a -70 ° C. </li><li> Vírus de título em células Vero. I placa geralmente de 10 0 a 10 -8 diluição (cada um sendo uma diluição de 10 vezes) a partir de 2 x 2 conjuntos de diluição separadas. Titulação do vírus é realizada em placas de 12 poços estéreis. </li></ol> 2. Infecção do mouse <ol><li> Injectar cada rato com 0,1 ml de anestésico cocktail/20 peso corporal do rato g (cetamina, 60 mg / kg de xilazina + 5 mg / kg, que é diluído em HBSS). Este coquetel é usado porque ele é um dos mais seguros meios de anestesia quando doses adequadas são utilizados e os efeitos da droga são muito curta. </li><li> Quando os ratos são anestesiados arranhar a córnea do olho direito, com uma agulha de calibre 30, utilizando um microscópio de dissecação para assegurar que a córnea não é perfurada. </li><li> Cada rato received uma injecção intraperitoneal de 1 ml de soro humano (Sigma, Temecula, Califórnia; reactividade anti-HSV com uma dose efectiva para 50% de neutralização viral de 1:800), a fim de proteger as córneas de danos durante a infecção primária. </li><li> Número os ratos com clipes ou qualquer um dos ouvidos pela orelha soco. </li><li> Depois de todos os ratinhos foram contados, usando um pipetador de 20 ul, que infectam cada olho com 10 6 PFU (5 ul). Nós infectar apenas um olho e normalmente o olho direito. Nós também colocar 5 ul de HBSS para o outro olho para mantê-lo húmido enquanto eles são anestesiados. 5 ul é suficiente para manter a hidratação dos olhos uma vez que os procedimentos são realizados em menos de 10 min, e os animais são doseados com anestésico em conformidade. A infecção é confirmada por raspagem ratinhos 3 dias pós-infecção com um aplicador de algodão estéril que foi hidratado em 1 ml de meio de Vero. Em seguida, 100 ul é adicionada a células Vero cultivadas em placas de 48 poços. Estas placas estão monitorando diariamente para efeitos citopáticos<html> (ECP). </li></ol> 3. Reativação do Ratos de Latência <ol><li> Os ratos são anestesiados pelo menos 5 semanas após a infecção primária. Deve notar-se que nos ratos reactivadas até um ano após a infecção primária e não observaram diferenças significativas nas respostas. </li><li> Uma vez anestesiados são colocados TM20 transiluminador cromatografia, Vu, que emite radiação UV-B a um comprimento de onda máximo de 302 nm de tal forma que apenas um único olho é exposto à luz UV-B. Cada rato é exposto a 250 cm de luz mJ de UV-B 2. </li><li> A reactivação é determinada por raspagem olhos com aplicador de algodão estéril, que é primeiro colocada em 1 ml de meio de Vero no dia 0 (antes da exposição ao UV-B para controlar shedders espontâneas) e, em seguida, em 1-7 dias pós-irradiação UV-B. O material de mecha é avaliada como descrito em 2.5). Para aqueles que têm zaragatoas vírus infeccioso a quantidade de vírus é tituladas por um ensaio de placas padrão utilizando placas de 12 poços. </li></ol>ove_title &quot;&gt; Avaliação 4. Clínica <ol><li> Os ratinhos são avaliados para a doença ocular clínico por um observador cego, utilizando um microscópio binocular de dissecação. </li><li> Opacidade da córnea é classificado numa escala de 0 a 4, onde 0 indica estroma clara, 1 indica a opacificação do estroma ligeira, 2 indica opacidade moderada com características discerníveis íris, 3 indica a opacidade densa, com perda de detalhe definido íris excepto margens da pupila, e 4 indica opacidade total com nenhuma visão posterior. </li><li> A neovascularização é classificado numa escala de 1-8, dividindo a córnea em quatro quadrantes iguais e determinar a extensão da vascularização em cada um destes quadrantes. </li><li> Blefarite é medida da seguinte forma: 0, sem lesões; 1, pálpebra mínimo inchaço; 2, descarga ocular moderada inchaço e mal-humorado, 3, inchaço grave, perda de cabelo moderada periocular, e lesões de pele, e 4, inchaço grave com os olhos fechados para crostas, perda de cabelo grave periocular, e lesões de pele. </li><li> Evidência de encefalite inclusãoded corcunda, cabelo babados e óbvias anormalidades neurológicas. Os ratos são sacrificados quando eles exibem sinais significativos de encefalite. </li></ol> 5. Resultados representativos O modelo de repetição, que foi descrito acima, foi publicada pela primeira vez por Shimeld, et al. 1-3. Eles testaram e nosso laboratório tem vindo a utilizar uma versão modificada do modelo de publicar muitos manuscritos sobre os 4-15 anos. O modelo foi utilizado para definir o papel que a citoquina interferon γ-peças na doença recorrente por HSV-1 10. Como mostrado na Figura 3, os ratos que faltam IFNy exibida pior doença da córnea do que ratinhos de tipo selvagem 14. Também foi usado com sucesso para definir o valor terapêutico da vacina diferente várias construções 6,10,11. Note-se que, num caso, a vacina testada funcionou bem profilacticamente, mas não provou ser terapeuticamente eficaz 6. No entanto,quando uma vacina de replicação incompetente-viral foi testado, não só foi eficaz profilacticamente, mas também foi muito eficaz terapeuticamente 10,11, ver a Figura 5 na referência 10. Mais recentemente temos usado este modelo para determinar se as diferenças de gênero foram detectáveis ​​em ratos submetidos a HSK recorrente. Como a Figura 1 mostra, camundongos machos C57BL / 6 exibir opacidade da córnea significativamente menos do que os do sexo feminino C57BL / 6 ratos. Da mesma forma, quando a neovascularização da córnea, foi avaliado, ratos macho demonstraram significativamente menos o crescimento dos vasos de novo na córnea do que ratinhos fêmea (Figura 2). No momento, estamos testando se este fenótipo é cepa específica através da realização de análise semelhante em outras linhagens de camundongos. Nós também irá determinar se a diferença é devida à falta de testosterona ou a presença de estrogénios. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig1.jpg" /> Figura 1. Doença de córnea em C57BL masculino e feminino / 6 linhagens de camundongos após UV-B reativação induzida. Ratinhos com infecção latente foram induzidos para reactivar com irradiação UV-B e os ratinhos foram monitorizados quanto a opacidade da córnea durante 35 dias. O número de ratos utilizados nestes estudos foram os seguintes: os machos, n = 15; fêmeas, n = 15. Os resultados indicam a média ± SEM. * Não foi significativamente maior doença induzida por vírus em ratinhos fêmea C57BL / 6 para os dias 14-35 (P = 0,001-0,01). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4276/4276fig2.jpg" /> Figura 2. Doença de córnea em C57BL masculino e feminino / 6 linhagens de camundongos após UV-B reativação induzida. Ratinhos com infecção latente foram induzidos para reactivar com irradiação UV-B e os ratinhos foram monitorizados quanto a neovascularização da córnea durante 35 dias. O número de ratos utilizados nestes estudos foram os seguintes: os machos, n= 15; fêmeas, n = 15. Os resultados indicam a média ± SEM. * Não foi significativamente maior doença induzida por vírus em ratinhos fêmea C57BL / 6 para os dias 14-28 (P = 0,001-0,01).

<ol>
	<li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+model+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice.">An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).</li><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+latent+infection+and+induction+of+recurrent+herpetic+eye+disease+in+mice.">Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice.</a> J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).</li><li>Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+immunization+protects+the+mouse+eye+from+damage+after+herpes+simplex+virus+infection+by+limiting+spread+of+virus+in+the+nervous+system.">Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system.</a> J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).</li><li>Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+murine+model+of+recurrent+herpes+simplex+viral+keratitis+induced+by+ultraviolet+B+radiation.">Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).</li><li>Keadle, T. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+ameliorates+corneal+disease+in+a+mouse+model+of+recurrent+herpetic+keratitis.">IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis.</a> Microbial Path. 38, 13-21 (2005).</li><li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+a+recombinant+glycoprotein+D+subunit+vaccine+on+the+development+of+primary+and+recurrent+ocular+infection+with+herpes+simplex+virus+type+1+in+mice.">Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice.</a> J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).</li><li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines+IL-1+and+TNF-a+are+required+for+recurrent+herpetic+keratitis+in+NIH+mice.">Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).</li><li>Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+cytokine+expression+in+a+murine+model+recurrent+herpetic+stromal+keratitis.">Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).</li><li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++and+CD8++cells+are+key+participants+in+the+development+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice.">CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> Microbial Path. 32, 255-262 (2002).</li><li>Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+immunization+with+a+virion+host+shutoff-defective,+replication-incompetent+herpes+simplex+virus+type+1+strain+limits+recurrent+herpetic+ocular+infection.">Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection.</a> J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).</li><li>Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+vaccination+with+vhs(-)+herpes+simplex+virus+reduces+the+severity+of+recurrent+herpetic+stromal+keratitis+in+mice.">Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice.</a> J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).</li><li>Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aminoguanidine+on+primary+and+recurrent+ocular+herpes+simplex+virus+infection.">The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection.</a> Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).</li><li>Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL3+protects+mice+from+corneal+pathology+during+recurrent+HSV-1+infection.">CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection.</a> Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).</li><li>Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+is+not+required+for+recurrent+herpetic+stromal+keratitis.">Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis.</a> Virology. 380, 46-51 (2008).</li><li>Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+Interferon-gamma+by+an+adenovirus+vector+blocks+herpes+simplex+virus+Type+1+reactivation+in+vitro+and+in+vivo+independent+of+RNase+L+and+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+pathways.">Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways.</a> J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O modelo de repetição de ceratite herpética estromal (HSK) aqui descrito permite ao investigador para estudar HSK humano num modelo que é mais consistente com o que é observado durante a doença humana. Assim, as intensidades do modelo são a doença que ocorre no contexto de um sistema imunitário que tem já por estimulado durante a doença primária. Uma vez que estes ratos já têm uma resposta imune contra HSV-1, os factores que reativam resposta imunitária que provavelmente diferentes daqueles que originalme...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5796</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7023</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-005-C1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/ Strep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15290018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>Legend RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>52-21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transilluminatior</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0452-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicatior</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Sonifier 450</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>Z 720410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks- 7150</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates- 12 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS 3513</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plates- 48 well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS 3548</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Conical Tubes- 30 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS 430828</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cotton-tipped Applicators</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G Needles</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309602</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recurrent herpetic stromal keratitis in mice, a model for studying human hsk

Doença ocular herpética, denominado ceratite herpética estromal (HSK), é uma infecção potencialmente ofuscante da córnea, que resulta em mais de 300.000 por ano visitas clínicas para o tratamento. Entre 1 e 2 por cento dos pacientes com doença clínica vai ocorrer perda de visão da córnea infectada. A grande maioria destes casos é o resultado da reactivação de uma infecção latente pelo vírus herpes simplex tipo I, vírus e não devido a doença aguda. Curiosamente, a infecção aguda é o modelo mais usado para estudar essa doença. No entanto, considerou-se que um modelo recorrente de HSK seria mais reflexivo do que ocorre durante a doença clínica. Os modelos animais recorrentes para HSK ter empregado dois coelhos e ratos. A vantagem é que os coelhos que experimentam a reactivação da latência na ausência de qualquer estímulo conhecido. Dito isto, torna-se difícil explorar o papel que muitos factores imunológicos desempenham na HSK recorrente, porque o modelo de coelho não tem o immunrecursos genéticos e fisiológicos que o mouse possui. Optamos por utilizar o modelo de mouse para HSK recorrente porque tem a vantagem de haver muitos recursos disponíveis e também sabemos quando reativação ocorrerá porque a reativação é induzida pela exposição à luz UV-B. Até agora, este modelo tem permitido os laboratórios de usá-lo para definir vários fatores imunológicos que são importantes para esta doença. Também permitiu-nos testar a terapêutica e a eficácia da vacina.

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Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

A maioria dos estudos de doença herpética corneal utilizar um modelo de infecção primária. No entanto, a infecção primária por HSV-1 normalmente não conduzem à doença humana. Aqui nós descrevemos um modelo recorrente de doenças da córnea herpética, que mais imita a doença humana.

Ceratite herpética recorrente Estroma em camundongos, um modelo para estudar HSK Humanos

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

recurrent-herpetic-stromal-keratitis-mice-model-for-studying-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K visualizações.  Saint Louis University. A maioria dos estudos de doença herpética corneal utilizar um modelo de infecção primária. No entanto, a infecção primária por HSV-1 normalmente não conduzem à doença humana. Aqui nós descrevemos um modelo recorrente de doenças da córnea herpética, que mais imita a doença humana.