Общая цель этой процедуры заключается в применении современных оптогенетических методов для фотостимуляции целевых нейронных путей в препаратах срезов in vitro. Это достигается путем первичной экспрессии канального стержня Dossin в представляющих интерес нейрональных клеточных линиях. Вторым этапом процедуры является проведение острых срезов препаратов соответствующих структур мозга, подлежащих исследованию.
Следующим шагом является регистрация ответов нейронов в препарате среза в ответ на фотостимуляцию канала, палочки Доссина, экспрессирующих волокна. Заключительным этапом является визуализация распределения нейронов и волокон, экспрессирующих опсин канала. В конечном счете, этот подход позволяет оценить функциональную топографию и синаптические свойства нейронных цепей с помощью лазерного сканирования, фотостимуляции оптогенетически нацеленных нейронных компонентов.
Основными преимуществами этого метода по сравнению с традиционными методами электростимуляции являются возможность целенаправленно нацеливаться и стимулировать определенные типы нейронных клеток и исследовать их проекции на большие расстояния in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области системной нейронауки, такие как функциональная организация сложных боевых гнезд. Подготовьте шприц и иглу для введения вирусного раствора, который содержит четыре микрограмма на миллилитр поли для усиления трансфекции.
Затем под давлением впрыскиваем 200 нанолитров раствора с помощью шприцевого насоса, через две-три недели произойдет адекватная экспрессия канального стержня слайса Доссина. Подготовка должна быть выполнена как можно быстрее После удаления введенного мозга сделайте блок мозга в нужной ориентации с помощью чистого бритвенного лезвия. Далее прикрепите заблокированную поверхность мозга к этапу резки с помощью мгновенного клея с помощью мгновенного клея.
Затем перенесите столик в морозильную камеру охлажденного вибрама и залейте ледяной ликвор в режущую камеру. Разрежьте участки мозга с помощью виома на участки толщиной от четырех до 500 микрон. Перенесите срезы мозга в насыщенную кислородом камеру и дайте им инкубироваться при температуре 30 градусов Цельсия в течение как минимум часа, прежде чем приступить к эксперименту.
Когда все будет готово к началу эксперимента, перенесите срез мозга на стадию электрофизиологической регистрирующей установки. Запишите нейрон с помощью стандартных методов зажима целых клеток. Кратковременно расположите записывающую пипетку рядом с нейроном, оказывая положительное давление на пипетку.
После контакта с клеткой сбросьте давление и примените всасывание, чтобы сформировать гига-уплотнение. Затем примените кратковременное всасывание, чтобы разорвать мембрану для конфигурации всей ячейки, и сделайте записи в режимах зажима напряжения или тока. Работайте с лазерным сканером с помощью программного обеспечения для сбора данных приливных волн или EFA.
Программное обеспечение должно быть откалибровано на фотодиод перед использованием для управления мощностью лазера. На его пути размещается колесо переменной нейтральной плотности. Вращение колеса регулирует мощность лазера, измеряя его в задней фокальной плоскости.
Мощность обычно устанавливается в диапазоне от 25 до D милливатт. Параметр импульса затвора контролирует длину и время стимуляции в программном обеспечении. Изображение области, подлежащей стимуляции, может быть получено с помощью функции захватного видео.
Затем установите сетку стимуляции, например, сетку 16 на 16 с шагом 80 микрон. Затем наложите сетку на полученное изображение и отрегулируйте координаты XY и степень смещения, чтобы оптимизировать ориентацию для начала стимуляции. Активируйте функцию карты.
Данные сохраняются и могут быть проанализированы с помощью автономной программы анализа в приливной волне или могут быть проанализированы с помощью программы анализа карт в программном обеспечении EFA. После завершения физиологических записей на срезе можно задокументировать паттерн экспрессии меченного YFP опсина канала. Сначала зафиксируйте срез на ночь в 4% PFA в 0,01 моляра PBS при четырех градусах Цельсия.
На следующий день переложите срез в 30%-ный раствор сахарозы 4%-ного PFA для криозащиты на ночь. На следующий день отрежьте на криостатике участки среза по 50 микрон. Промойте срезы в PBS и установите их для визуализации с помощью среды, препятствующей выцветанию, в конфокальный микроскоп.
Найдя интересующую область в белом свете, используйте возбуждающую длину волны 514 нм и длину волны излучения 527 нм. Получить изображение вирусной конструкции YFPA, которая управляет экспрессией канального стержня Добсона, EYFP. В возбуждающих глутаматергических нейронах вводили в первичную зрительную кору мыши BSY.
Вирусная экспрессия была обнаружена в следах между первичной и вторичной зрительной корой, а в кортико-таламических волокнах клеточного зажима LGN была обнаружена запись с нейрона во вторичной зрительной коре, отмеченной звездой. После лазерного сканирования фотостимуляции канала, палочка Доссина экспрессирует волокна в нижних слоях V двух кортико-таламических проекций из шестого слоя первичной соматосенсорной коры. Вентральные задние ядра были изучены с использованием подхода CRE LAX для экспрессии канального палочкового дозина в кортико-таламических нейронах шестого слоя, и в их проекциях, как и ожидалось, трансфекция стайной V-образной конструкцией в трансгенную мышь CRE привела к экспрессии канального палочкового дозина в целевом шестом слое нейронов и их волокнах, распространяющихся до четвертого слоя.
По каналу Добсона, экспрессия EYFP также была отмечена в волокнах, проецирующихся на физиологические записи VP от VP-нейрона. Использование клеточного зажима показало, что электронные ПСК могут быть вызваны после фотостимуляции вблизи зарегистрированного нейрона, который отмечен звездой. Автономный анализ показывает среднюю амплитуду отклика на фотостимуляцию в VP Резекция 50 микрон кортико-таламических нейронов шестого слоя, экспрессирующих канал Родена, EYFP выявила тонкий узор меченых волокон, проходящих от шестого слоя к четвертому, где они заканчиваются и широко обрывается.
Кроме того, наблюдалось, как кортико-таламические волокна входят в белое вещество и проходят по направлению к таламусу. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как применять современные оптогенетические методы для фотостимуляции целевых нейронных путей в препаратах срезов in vitro. Не забывайте, что работа с лазерами может быть чрезвычайно опасной, когда вы выполняете этапы калибровки, связанные с этой процедурой.
Носите защитные очки.
