Эта работа была выполнена при финансовой поддержке исследовательского гранта от комбинации Голландский Национальный исследовательский школе, катализа Управляется химической дизайна (NRSC-катализа). Д-р HY Steensma и д-р GPH ван Heusden из Лейденского университета признаны за их поддержку с рекомбинантной экспрессии S. Cerevisiae Nar1.

1. Подготовка установки и решения <ol><li> Подготовка буферного раствора, содержащего 100 мМ Трис, 250 мМ NaCl и 10% глицерина при рН 8,5. Воздух из буфера продувкой аргоном. Представьте буфер в анаэробной камере. </li><li> Разделить буфер на две части. Для одной порции (буфер А) добавляют 1 мМ DL-дитиотреитола (ДТТ, M R 154,25 г / моль) и 1 мМ L-цистеин. Другая часть (буфер Б) не содержит восстановителей. </li><li> Подготовка окислителя и восстановителя решения. Сделать 1 мл растворов 2, 20 и 200 мМ калий феррицианид (FIC, M R 329,26 г / моль) и дитионит натри (SD, M R 174,11 г / моль) в анаэробной буфере В. </li><li> Подготовка медиаторов смесь следующим образом: <ol><li> Добавить 160 мкМ каждого из следующих окислительно-восстановительных медиаторов и 50 мМ NaCl буфера В: N, N, N &#39;, N&#39; тетраметил-п-phenylendediamine (TMPD, M R 237,17 г / моль, E &#39;0 0,276 В) , 2,6-дихлорфенол индофенол(DCIP, M г 290,08 г / моль, Е &#39;0 0,217 V), феназинэтосульфата (PES, M г 334,4 г / моль, Е&#39; 0 0,055 V), метиленовый синий (M R 319,85 г / моль, Е &#39; 0 0,011 В), ресоруфина (М г 235,17 г / моль, Е &#39;0 -0,051 В), Indigodisulphonate (М г 466,35 г / моль, Е&#39; 0 -0,125 В), 2-гидрокси-1,4-naphtaquinone ( M R 174,15 г / моль, Е &#39;0 -0,145 V), Антрахинон-2-сульфонат (M R 328,28 г / моль, Е&#39; 0 -0,225 V), Phenosafranin (M R 322,8 г / моль, Е &#39;0 -0,252 V), сафранин О (М г 350,84 г / моль, Е &#39;0 -0,280 В), нейтральный красный (М г 288,8 г / моль, Е&#39; 0 -0,340 В), бензил виологен (М г 409,4 г / моль, Е &#39;0 -0,350 V), и метилвиологену (M г 257,16 г / моль, Е&#39; 0 -0,440 V). </li><li> Оберните бутылку в алюминиевой фольгой для защиты посредникас от света. </li></ol></li><li> Подготовка 10 мг / мл S. Cerevisiae септический тегами Nar1 белка (181 мкМ, M R 55,2 кДа) в буфер А. Экспресс S. Cerevisiae Nar1 в E. палочки, как стрептококковой с метками белка с использованием вектора экспрессии pET24A. Очищают белка в анаэробной камере с помощью Стрептококковое-tactin хроматографии массовой информации (МБА) и очистить с помощью системы очистки белка, такие как AKTA очиститель (GE Healthcare). </li><li> Подготовка установки окислительно-восстановительным титрованием в анаэробной камере следующим образом: <ol><li> Подключение электрод Ag / AgCl и платиновый проволочного электрода к титрования. Подключите оба электрода к вольтметру, который может измерять от мВ до V. </li><li> Вставьте небольшую мешалки. </li><li> Поставьте сосуд для титрования над магнитной мешалкой. </li><li> Заполните сосуд для титрования с буфером B, раствор медиатором смеси и раствора белка до до 2 мл, т.е. до конечной концентрации 72 мкМ белка и 38 мкМ каждогопосредник. Примечание: в зависимости от концентрации белка и требуемое медиатором концентраций суммы трех растворов должна быть отрегулирована. </li><li> Перемешивают в течение 30 мин и включить вольтметр. </li></ol></li><li> Подготовка 10 чистых кварцевых стекольных ЭПР трубы. Представьте трубки в анаэробной камере. </li><li> Заполните небольшой (около 200 мл) жидкий азот Дьюара с жидким азотом. </li></ol> 2. Выполните окислительно-восстановительного титрования <ol><li> Подождите, пока потенциал раствора не является стабильным. Примечание: На практике это означает, что потенциал дрейфует менее 1 мВ на минуту. </li><li> Запишите потенциалом при вольтметром. </li><li> Нарисуйте первый образец 200 мкл и вводят в ЭПР трубы. </li><li> Закройте пробирку крышкой с резиновой пробкой и снимите трубку от анаэробной камере. </li><li> Замораживание трубку в жидком азоте следующим образом: Внимание! Это должно быть сделано медленно, в противном случае трубка сломается. <ol><li> Сначала вставьте тф трубки в жидкий азот. </li><li> Подождите, пока шипение не может быть услышан. Примечание: Это может занять до 10 секунд. </li><li> Медленно вставьте остальную часть трубки так, чтобы образец часть полностью погружен в воду. </li></ol></li><li> Добавить Небольшую аликвоту 1-2 мкл раствора 2 мМ SD к раствору в сосуд для титрования, чтобы понизить потенциал раствора до -0,6 В. Примечание: Если больше чем 10 мкл должен быть добавлен, перейти к раствору 20 мМ. Как это очень трудно, чтобы балансировать на определенный потенциальную ценность, фактические значения, записанные на вольтметра записываются и используются для построения кривой титрования. </li><li> Нарисуйте образец, как описано в шаге 2,3-2,5. </li><li> Запишите реальный потенциал, данное вольтметра. </li><li> Добавить окислитель, пока потенциал не вырос на почти 50-мВ. Начало добавлением небольшого аликвоту 1-2 мкл раствора 2 мМ FIC. Если более чем 10 мкл должен быть добавлен, перейти к раствору 20 мМ. </li><li> Запишите хоW много решений была добавлена. Примечание: Это необходимо для коррекции разведения образцов в процессе титрования. </li><li> Нарисуйте образец, как описано в шагах 2,3-2,5. </li><li> Запишите реальный потенциал, данное вольтметра. </li><li> Повторите шаги 2,9 и 2,12 до потенциального диапазоне от -0,6 В до +0,2 V была закрыты, а все 10 ЭПР трубы заполнены каждый с 200 мкл. Примечание: В объем с каждым выводом уменьшается расположение электродов может возникнуть необходимость отрегулировать имеют хороший контакт с раствором без вмешательства перемешивании. Это может быть трудно измерить потенциал после вывода последнего образца и, следовательно, потенциал этого образца может быть менее точной. </li><li> Возможно, хранить замороженные образцы ЭПР в жидком азоте до измерения ЭПР не может иметь место. </li></ol> 3. Измерьте титрования проб с использованием ЭПР-спектроскопии и анализа данных <ol><li> Запись спектров ЭПР отличаетсяОбразцы титрования следующим образом: <ol><li> Используйте насоса высокого вакуума для вакуумирования кварцевый криостат &lt;10 -5 бар. </li><li> Включите водяного охлаждения магнита ЭПР. Открыть поток сухого воздуха через полость ЭПР. </li><li> Включите источник питания к магниту и компьютером ЭПР. </li><li> Запустите программу калибровки частоты. Установите параметры измерения ЭПР. Подключите криостат жидкого сосуде Дьюара гелия. Охладите полости 9-16 К. </li><li> Представьте образец ЭПР в полости. Запишите спектр ЭПР. </li></ol></li><li> Определение различных ЭПР видов и использовать лучшие спектры для количественного определения сигналов. Достижение ЭПР количественного двойным интегрированием спектров и сравнения со спектром внешнего меди стандартного раствора 10 мМ CuSO 4/10 мМ HCl / 2 M NaClO 4. 8 </li><li> Сделайте кривую титрования следующим образом: <ol><li> Участок амплитуду сигнала ЭПР в г-значение, которое характерно для парамагнитные видов интерес в отношении потенциала. </li><li> Изменить ЭПР масштаб амплитуды сигнала спинов / масштаб молекул с помощью ЭПР количественную, начиная с шага 3.2. </li><li> Откорректируйте амплитуды сигнала каждого образца для разбавления, что произошло из-за добавок окислительной или восстанавливающего агента. </li><li> Исправьте потенциал для средней точки потенциала электрода сравнения Ag / AgCl. Примечание: электрод сравнения Ag / AgCl (насыщенным KCl) имеет среднюю точку потенциал V 0,194 по сравнению с стандартной водородного электрода (она) при 25 ° С. Таким образом, если потенциал на вольтметра около -0,6 В, потенциал со ссылкой на она -0,4 В. </li></ol></li><li> Установить сигнал к уравнению Нернста следующим образом: Для вида, парамагнитен в восстановленном состоянии: <img alt="Уравнение 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq1.jpg" width="200" /> Для вида, парамагнитен в Oxidized состояние: <img alt="Уравнение 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq2.jpg" width="200" /> Для вида, парамагнитен в промежуточном состоянии: <img alt="Уравнение 3" fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq3.jpg" width="220" /> Эти уравнения действительны для окислительно-восстановительных реакций, в которых один электрон переходит, так что N = 1. E = потенциал в вольтах E M = середина потенциал в вольтах F = постоянная Фарадея = 96480 C · моль -1 R = газовая постоянная = 8,314 Дж · K -1 · моль -1 T = температура в градусах Кельвина </li></ol>

<ol>
	<li>Lippard, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).</li><li>Bertini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).</li><li>Leger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+Electrokinetics:+Using+Protein+Film+Voltammetry+To+Investigate+Redox+Enzymes+and+Their+Mechanisms.">Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms.</a> Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).</li><li>Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Electron+Transfer+of+Redox+Proteins+at+the+Bare+Glassy+Carbon+Electrode.">Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode.</a> Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).</li><li>Pierik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Properties+of+the+Iron-Sulfur+Clusters+in+Activated+Fe-Hydrogenase+from+Desulfovibrio+vulgaris+(Hildenborough).">Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough).</a> Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hydrogenase-like+Nar1p+is+Essential+for+Maturation+of+Cytosolic+and+Nuclear+Iron-Sulphur+Proteins.">The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins.</a> EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).</li><li>Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Iron-Sulfur+Cluster+Assembly+(CIA)+System:+Factors,+Mechanism,+and+Relevance+to+Cellular+Iron+Regulation.">Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation.</a> J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).</li><li>Aasa, R., V&#228;nng&#229;rd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+Signal+Intensity+and+Powder+Shapes.">EPR Signal Intensity and Powder Shapes.</a> A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., M&#252;hlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nar1p,+a+conserved+eukaryotic+protein+with+similarity+to+Fe-only+hydrogenases,+functions+in+cytosolic+iron-sulphur+protein+biogenesis.">Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis.</a> Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).</li><li>Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferene+-+a+new+spectrophotometric+reagent+for+iron.">Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron.</a> Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).</li><li>Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarase+A+from+Escherichia+coli:+purification+and+characterization+as+an+iron-sulfur+cluster+containing+enzyme.">Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme.</a> Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).</li><li>Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch, ., Landa, I., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+Redox+Chemistry:+a+Re-evaluation.">Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation.</a> FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).</li><li>Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+relative+contributions+of+redox+and+steric+issues+to+laccase+specificity+towards+putative+substrates.">An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates.</a> Organic &amp; biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Серия 13 окислительно-восстановительных посредников позволяет окислительно-восстановительный баланс в растворе в диапазоне от -0,45 до +0,3 против SHE (таблица 1 и рисунок 3). Хорошо выше и ниже этих потенциалов все медиаторы или полностью уменьшен или полностью окисляется ...

Поразительно, что наиболее фундаментальные химические процессы поддерживая жизнь на этой планете, фотосинтез, фиксация азота и дыхания, катализируют крупных белковых комплексов, содержащих широкий спектр органических и неорганических окислительно-восстановительных кофакторов. Было подсчитано, что примерно 30% всех белков содержать один или несколько металлов кофакторов. 1,2 идентификации и характеристике окислительно-восстановительные кофакторы может быть установлена ​​с помощью прямого электрохимии (например, белок, пленка вольтамперометрии) или окислительно-восстановительные титрования. Два метода дополняют друг друга по своей природе и применимости. Вольтамперометрия обеспечивает быструю определение средней точки потенциалов и переноса электронов кинетики кофакторов, которые могут реагировать с поверхностью электрода. 3,4 Обычно это хорошо работает для электронного переноса белков, таких как цитохром с и ферредоксин. И это иногда работает в более сложных белков, которые были иммобилизованных на поверхности электрода. Детальное знаниеприрода кофакторов в белке должна быть доступна, как вольтамперограмма не даст никакого прямую информацию о личности кофактора. Окислительно-восстановительные титрования более трудоемкий для выполнения и требует мг количества белка. Тем не менее, они дают информацию о средней точке потенциала и идентичности кофактора. 5 Кроме того, в одном титрования несколько кофакторов в белке можно контролировать. Принцип окислительно-восстановительным титрованием в том, что окислительно-восстановительный активный белок или фермент, химически восстановлении или окислении. Для того, чтобы убедиться, что алгебраические реагируют с восстановителем или окислителем окислительно-восстановительных посредников используются. Эти окислительно-восстановительные медиаторы также реагировать с электродом так, что потенциал раствора можно измерить. Медиаторы действуют в качестве буфера окислительно-восстановительного и равновесие между кофакторов в белке и электродом. После химически poising потенциал до желаемой величины, выборка и быстро замораживали в жидком азоте, чтобы AWгаются дальнейшего анализа с методами спектроскопии. ЭПР является особенно полезным в этом отношении, как он может быть использован для количественного измерения металлические центры парамагнитные или органические радикалы. Окислительно-восстановительное титрование может быть осуществлено в двух направлениях: от низкой до высокой или от высокой к низкой средней точки потенциала. Выбор зависит от стабильности сомножителей при исследовании. Часто имеет смысл начать с низким потенциалом и добавить окислитель для ступенчатого повышения потенциала. Это называется окислительного титрования и описано здесь. Здесь мы показываем, окислительно-восстановительного титрования железа серы кластера, содержащего белок Nar1 из Saccharomyces CEREVISIAE. Этот белок участвует, скорее всего, в качестве белка лесов, в цитозоле Железосерные кластеры биосинтеза машин (ЦРУ путь). 6,7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference electrode (Ag/AgCl)</td>
			<td style="width:101px;">Radiometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EPR spectrometer</td>
			<td style="width:101px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) &#183;(HCl)2</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">637-01-4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">620-45-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenazine ethosulfate (PES)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">10510-77-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">122965-43-9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resorufin, sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">34994-50-8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Indigodisulfonate (indigo carmine)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">860-22-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-hydroxy-1,4-naphtaquinone</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">83-72-7</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">153277-35-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenosafranin</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">81-93-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safranin O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">477-73-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral red</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">553-24-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1102-19-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1910-42-5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epr monitored redox titration of the cofactors of saccharomyces cerevisiae nar1

Электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) мониторинг окислительно-восстановительные титрования являются мощным средством для определения средней точки потенциал кофакторов в белках и для выявления и количественной оценки кофакторов в их обнаруживаемого окислительно-восстановительного состояния. Техника является дополнением к прямому электрохимии (вольтамперометрии) подходы, как это не предоставляет информации о темпах переноса электронов, но установить личность и окислительно-восстановительного состояния сомножителей в белке в стадии изучения. Техника широко применяется для какого-либо белка, содержащего электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) выявляемого кофактор. Типичный титрования требуется 2 мл белка с концентрацией кофактора в диапазоне 1-100 мкМ. Белок титруют с химическим восстановителем (дитионит натрия) или окислителем (феррицианид кали), с тем чтобы пуаз образца на определенном потенциале. Платиновой проволоки и электрода сравнения Ag / AgCl подключены к вольтСчетчик для измерения потенциала раствора белка. Набор 13 различных медиаторов редокс используется для уравновешивания между окислительно-восстановительных кофакторов белка и электродов. Образцы взяты на разных потенциалов и спектров электронного парамагнитного резонанса, характерных для различных кофакторов окислительно-восстановительных в белке, измеряются. Участок интенсивности сигнала от потенциала образца анализируют с помощью уравнения Нернста для того, чтобы определить среднюю точку потенциал кофактора.

Окислительно-восстановительный титрование Железосерные кластеры, содержащие белок Nar1 из Saccharomyces CEREVISIAE привело к идентификации трех различных кофакторов: Nar1: [3FE-4S] кластеров, [4Fe-4S] кластеров и мононуклеарных Fe-центр (Рисунок 1) , Сигналов ЭПР характеризуются их г-значений: д...

Watch this Scientific Journal Video about EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1 at JoVE.com

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

ЭПР Контролируемый окислительно-восстановительного титрования из кофакторами<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

epr-monitored-redox-titration-cofactors-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

13.4K Views.  Delft University of Technology. The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

Video: EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Количественные Phosphoproteomics в жирные кислоты Вынужденное Saccharomyces CEREVISIAE</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Выражение и очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка в Saccharomyces CEREVISIAE

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной<em&gt; В Ситу</em&gt; Гибридизация в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

В сочетании Анализы для мониторинга рефолдинг Белок в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Очистка муковисцидоза трансмембранного регулятора проводимости белка выражается в<em&gt; Saccharomyces CEREVISIAE</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Измерение мРНК темпы разложения в<em&gt; Saccharomyces Cerevisiae</em&gt; Использование<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Штаммы

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.