Assay набора клетки опухоли легких

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии опухоли о молекулярных механизмах метастазирования. Основным преимуществом этого метода является то, что набор опухолевых клеток в удаленном органе может быть количественно. Начните с использования не-энзиматической диссоциации клеток реагент для удаления флуоресцентных белков-экспрессирующих Льюиса карциномы легких, или ООО, клетки из их контейнера культуры в соответствии со стандартными протоколами.

Перенесите полученный клеточный раствор в 15-миллилитровую коническую трубку перед центрифугой, а центрифугу промыть гранулы два раза в пять миллилитров PBS на стирку. После второй стирки, фильтровать клетки через 40-микрометровый поры клетки ситечко, и разбавить подвеску в один раз от 10 до шести клеток на миллилитр концентрации. Затем загрузите клетки в одноми миллилитровый шприц, оснащенный иглой 29-го калибра, и ввейте 100 микролитров клеток в хвостовую вену каждой мужской мыши в возрасте от восьми до 10 недель, C57-Black-6.

В соответствующей экспериментальной конечной точке используйте ножницы, чтобы удалить кожу с брюшной поверхности каждой мыши, и вырезать ребра и диафрагму, чтобы разоблачить грудной полости. Используйте 25-го калибра крылатые инфузионные иглы и трубки, чтобы промыть 15 миллилитров PBS через правый желудочек, и удалить сердце и тимус. Сжимая трахею типсами, подтягивайтесь, рассекая соединительные ткани вокруг трахеи, чтобы собрать легкие.

Затем мыть легкие в PBS, и отделить одну долей для визуализации флуоресцентных клеток на месте под флуоресцентным микроскопом. Чтобы переварить легочную ткань, сначала нарежьте ножницами хвостовую долей и поместите кусочки легких в 10-миллилитровый шприц. Закройте шприц с поршенем, и аспирировать пять миллилитров раствора пищеварения в шприц, перемещая поршень в и из вала шприца, пока легочная ткань распространяется по всему раствору.

Разпределите легочную суспензию в 50-миллилитровую трубку и усваиваете ткань на взаимном шейкере в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия и 150 об/мин. В конце инкубации, тритурировать оставшиеся ткани, пока клетки легких полностью рассеяны, и вернуть трубку шейкер в течение еще 30 минут. Затем фильтровать клетки через 40-микрометровый ситечкой поры, и собирать клетки путем центрифугации.

Чтобы проанализировать изолированные клетки легких путем цитометрии потока, повторно посовестить гранулы в двух миллилитров буфера лиза красных кровяных телец в течение одной минуты при комнатной температуре, и собирать клетки центрифугации. Затем центрифуга гранулы два раза в пять миллилитров свежего PBS дополняется 1%бычьей сыворотки альбумин на стирку. После второй центрифугации, повторно гранулы в один миллилитр свежего PBS плюс BSA, и фильтровать клетки через новый 40-микрометровый ситечко поры для количественной оценки опухолевых клеток по цитометрии потока.

Легкие представляют много клеток GFP-LLC через два часа после инъекции, при этом подавляющее большинство клеток исчезает из легких в течение 24 часов. Обратите внимание, что любые флуоресцентные пятна, обнаруженные в красном фильтре, должны быть исключены из списка клеток. Для подтверждения количества GFP-LLC в легких, одна из долей может быть использована для цитометрического анализа потока, как попродемонстрировано.

При попытке этой процедуры, важно помнить, что замороженные процедуры раздела является более точным методом для наблюдения точное местоположение опухолевых клеток.