This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

1. Генерация воспроизводимо Sized опухолевых сфероидов <ol><li> Мойка опухолевых клеток монослоев фосфатным буферным раствором (PBS; 5 мл в течение 25 см 2 или 8 - 10 мл на 75 см 2 колбу), добавить диссоциации клеток фермент (1 мл на 25 см 2 или 2 мл в течение 75 см 2 колбу) и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 2 - 5 мин. </li><li> Проверка открепления клеток под микроскопом и нейтрализовать диссоциации клеток фермент с полной среде роста (5 мл на 25 см 2 или 8 мл на 75 см 2 колбу). </li><li> Центрифуга клеточной суспензии при 500 мкг в течение 5 мин. </li><li> Удалить супернатант, нажмите трубку и повторно приостанавливать осадок клеток в 1 мл полной среды роста с использованием пипетки P1000. Это должно привести к суспензии отдельных клеток без кластеров клеток. </li><li> Граф клеток с использованием гемоцитометра и разбавленной клеточной суспензии, чтобы получить 0,5 - 2 х 10 4 клеток / мл (необходимо оптимальное плотность клеток, которые будут определены для каждой линии клеток в Order получить опухолевые сфероиды 300 - 500 мкм, диаметр 4 дней после посева клеток 12,13). </li><li> Передача клеточной суспензии в стерильную резервуара и, используя многоканальную пипетку, обойтись 200 мкл / лунку в сверхнизкой крепления (ULA) 96-луночных круглодонных планшетах 12. </li><li> Передача пластины инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2, 95% влажности). Четыре дня спустя, визуально подтвердить образование сфероид опухоли и приступить к 3D вторжения анализа. </li></ol> 2. 3D опухоли Сфероид Вторжение Пробирной <ol><li> Оттепель BMM на льду. </li><li> Хранить набор стерильные наконечники пипеток с фильтром для Р10, Р200 и P1000 пипетки и стерильные пробирки (1,5 мл объема или больше в зависимости от общего объема, необходимого) при -20 ° С. </li><li> Поместите 96-луночные планшеты, содержащие ULA 4-дневных сфероидов на льду. </li><li> Используя многоканальную пипетку, аккуратно удалите 100 мкл / лунку среды роста от сфероида пластин. Для этого шага угла советы по направлению к INside стенка U-образным дном лунок, избегая контакта с нижней части скважины и расположение сфероидов; свести к минимуму нарушение сфероидов. </li><li> Использование ледяной советы, передавать BMM к ледяной труб. Для цитокин-индуцированный вторжения или оценочных исследований препарат, добавить реагенты (в 2х конечная концентрация) в СМЛ с использованием ледяной советы. Например, можно использовать эпидермальный фактор роста (EGF), чтобы стимулировать нашествие плоскоклеточный клеток карциномы лицензия CAL S и R. Все хорошо перемешать, вращая нежно, избегая образования пузырьков. </li><li> Аккуратно внесите 100 мкл СМЛ в U-нижней скважины, направленный кончик к внутренней стенке колодца. Этот шаг является самым важным, как, для оптимального анализа изображений, сфероиды должны оставаться в центре скважины 12. </li><li> Повторите шаг 2.6 для всех требуемых скважин, позволяющих 5 - 6 репликантов / состояние. При необходимости изменить в свеже-охлажденного наконечника. ПРИМЕЧАНИЕ: При более опытный, dispenSE ВММ с помощью многоканальной пипетки. </li><li> Использование стерильной иглой, удалить пузырьки, если они присутствуют. <ol><li> Использование микроскопа, визуально проверить, что сфероиды в центральном положении. Если нет, центрифуги пластины при 300 х г в течение 3 мин при 4 ° С. Это будет гарантировать, что сферические расположены в центре каждой лунке. </li></ol></li><li> Передача пластину инкубаторе при 37 ° С и позволяют БММ затвердеть. </li><li> 1 час спустя, с помощью многоканальной пипетки, осторожно добавить 100 мкл / лунку полной среды роста. Для цитокин-индуцированной вторжение или оценки лекарственных средств исследований, включают в себя цитокины или ингибиторов в среде (1x конечной концентрации). Кроме того, если реагенты не были добавлены к СМЛ в шаге 2.5, добавить их в среде в этой точке (3x желаемой конечной концентрации). </li></ol> 3. Автоматизированная Image Acquisition <ol><li> Сканирование пластины на цитометром (спецификацию см таблицу оборудования и материалов) на интервалах ГНАrting время от нуля (t0 = день вторжения анализа создана, сразу после этапа 2.10 до 72 ч, или 96 ч для более медленных вторжения опухолевых клеточных линий. </li><li> Выберите приложение &quot;Слияние&quot;. </li><li> Убедитесь, что сфероид находится в фокусе и, при необходимости, отрегулировать вручную и зафиксировать &quot;Фокус смещены. </li><li> В разделе &quot;сэмплирования настройки», выберите сканирования одной центральное поле зрения (FOV). После того ВММ, опухолевые сфероиды должен был жить в центральном положении, таким образом, нет необходимости сканировать весь колодец. </li><li> В программном обеспечении, определить скважины для сканирования, выделив их на тарелке карте. Нажмите на &quot;Начать проверку&quot;. ПРИМЕЧАНИЕ: сканирование автоматически сохраняются и могут быть просмотрены позднее в автономном режиме. </li></ol> 4. Автоматизированный анализ изображения <ol><li> Выберите приложение &quot;слияния&quot;. </li><li> В вкладке &quot;Анализ&quot;, отрегулируйте ApplicНастройки вания (например, &quot;точность&quot;: низкий, нормальный, высокий, &quot;пороговая интенсивность&quot;: 1 - 15) для получения точного сегментирования вокруг сфероида, в том числе клеточных процессов и invadopodia проходящих в СМЛ (рисунок 1). Настройте параметры для каждой линии опухолевых клеток и / или в различные моменты времени. В &#39;&#39; слияния приложений меры% площади, покрытой а вторгшимися клеток, в выбранном поле зрения. </li><li> Убедитесь, что настройки анализа являются подходящими (то есть, сегментация является точной) для других сфероидов в пластине, нажав на несколько различных скважин. Если сегментация не точно очертить сфероид, настроить параметры программы в дальнейшем. </li><li> Нажмите на кнопку &quot;Пуск анализ. </li><li> На вкладке «Результаты», проверить несколько скважин, чтобы проверить качество анализа. Экспорт &quot;Ну уровня данных&quot; в программе электронных таблиц. </li><li> Repeaт анализ для всех временных точках. Рассчитайте среднее% слияния для повторных лунок и участок вторжения (%) против слияния время в виде гистограммы, используя научную графиков и статистического программного обеспечения выбора. </li></ol> 5. Руководство Image Acquisition <ol><li> Запись изображения для каждого сфероида опухоли с интервалом, начиная с Т = 0 до 72 - 96 ч, в зависимости от скорости вторжения в клеточной линии в вопросе, с использованием инвертированного микроскопа (для 96-луночного планшета это занимает около 20 - 30 мин). Используйте цель 10X. Использование цели 4X при вторжению область слишком велика, чтобы быть полностью захвачен в поле зрения 10Х. </li><li> Сохранить каждое отдельное изображение приобретенные. </li><li> Для калибровки принять образы этап масштабной сетки (1 мм), используя обе цели 10X и 4X (и сохранять изображения). </li></ol> 6. Руководство Анализ изображения <ol><li> Откройте этап картографической сетки изображения в анализа изображений программное обеспечение выбора. </li><li> Введите Graticule измерения, единицы (мкм), цели используется (10X или 4X) и выполнить калибровку. Этот шаг необходим только один раз. Для последующего анализа изображений, просто перезагрузить необходимые параметры калибровки. </li><li> Откройте для анализа изображений вторжения и выберите параметры калибровки в зависимости от объектива микроскопа (10X или 4X) используется для получения изображения. <ol><li> Кроме того, импорт изображения, полученные на визуализации цитометрии (шаг 3) и проанализировать вручную, как описано для изображений, полученных с помощью инвертированного микроскопа (см результаты, показанные на рисунке 3 и рисунке 4). </li></ol></li><li> Измерьте площадь, покрытую сфероидов. <ol><li> В программном обеспечении, используемом здесь представительных результатов (спецификацию см таблицу оборудования и материалов), перейдите в &quot;меру&quot; и выберите &quot;Count / размер&quot;. Выберите &quot;Файл&quot;, затем &quot;Загрузить настройки&quot; и выберите предварительно определенную ASSAу настройки. Затем выберите &#39;Count&#39;. Сфероид, то следует точно сегментирован. </li><li> Кроме перейдите в &quot;Edit&quot;, затем &quot;Ничья / Слияние объектов&quot;, чтобы открыть окно &quot;Волшебная палочка / след&quot;. Используйте курсор палочка нажать на изображение сфероида и получить сегментацию. Выберите «следы» (в окне «волшебную палочку»), чтобы вручную выделить сфероид с помощью мыши. </li></ol></li><li> Экспорт измерения различных параметров (площадь, диаметр, периметр и т.д.) в таблицу. Запись на таблицу релевантные данные изображения (например, количество и относительная момент времени). </li><li> Участок средней площади повторных сфероидов (вторжения) в зависимости от времени, используя научную графиков и статистического программного обеспечения. Кроме того, рассчитать изменение сфероида области на каждый момент времени, по отношению к области при Т = 0. Тогда участок вторжение (% t0) в зависимости от времени в качестве линейного грател. </li></ol>

<ol>
	<li>Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+evaluation+of+in+vitro+cell+culture+models+for+high-throughput+drug+screening+and+toxicity.">A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity.</a> Pharmacology &amp; therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).</li><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Dimensional+vs.+Three-Dimensional+In+Vitro+Tumor+Migration+and+Invasion+Assays.">Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays.</a> Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).</li><li>Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invadopodia+formation+in+oral+squamous+cell+carcinoma:+the+role+of+epidermal+growth+factor+receptor+signalling.">Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling.</a> Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+invadopodia+formation+for+lung+carcinoma+invasion+with+a+microfluidic+3D+culture+device.">Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device.</a> PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).</li><li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+the+microenvironment:+plasticity+and+reciprocity.">Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li><li>Brekhman, V., Neufeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+asymmetric+3D+in-vitro+assay+for+the+study+of+tumor+cell+invasion.">A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion.</a> BMC Cancer. 9, 415 (2009).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Nystrom, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture.">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).</li><li>Deisboeck, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+self-organization+in+tumour+systems:+complex+growth+dynamics+in+a+novel+brain+tumour+spheroid+model.">Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model.</a> Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).</li><li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation.">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29 (2012).</li><li>Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods and Protocols. , 253-266 (2013).</li><li>Box, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+serum+protein+signature+associated+with+resistance+to+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).</li><li>Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effect+of+growth+factors+on+invasion+and+proliferation+of+endocrine+resistant+breast+cancer+cells.">Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells.</a> PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).</li><li>Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+is+expressed+by+human+glioma+in+vivo+and+shows+a+strong+association+with+tumor+blood+vessels.">Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels.</a> Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).</li><li>Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+glioblastoma+cells+acquire+stemness+and+increased+Akt+activation.">Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation.</a> Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).</li></ol>

Все авторы заявляют никакого конкурирующего конфликт интересов.

Эти две модели опухоли, описанные здесь, (глиобластомы и ПРГШ) были специально выбраны для иллюстрации нашего анализа 3D, как они клинически значимых локально инвазивного рака с неудовлетворенной потребности в эффективных методов лечения 12. После медикаментозного лечения, оценки в пробирке изменений фармакодинамических (PD) биомаркеров может быть выполнена легко вестерн-блоттинга или иммунологических лизатов после использования специальных коммерчески доступных реагентов, чтобы позволить восстановление клеток от СМЛ и / или иммунофлуоресцентного анализа вторжения опухолевых сфероидов по вся Крепление окрашивание. Это вторжение анализ является полезным методом для быстрого и воспроизводимого оценки вторжения опухолевых клеток в полутвердой среде и, следовательно, особенно подходит для будущего в пробирке скрининга наркотиков. Раковые клетки проникают в матрицу в 3D, как они распространяются от &quot;микро-опухоль», в лице сфероида опухоли, а также расширить в extracellulAR-матрица, как окружающая среда. Истинный трехмерность анализа проявляется в морфологии клеток, который отличается от плоской, прилипшего морфологии клетки предполагать при перемещении на твердой подложке. Степень инвазии легко количественно с использованием либо изображений цитометра, позволяя автоматизированную считывания или с помощью стандартного микроскопа в сочетании с программным обеспечением обработки изображений. Кроме того, этот способ пригоден для флуоресцентных изображений 13 (например, с клеточных линий, экспрессирующих флуоресцентные белки или предварительно меченных флуоресцентными красителями). Метод прост в исполнении, с той лишь критической стадии, представленной добавлением СМЛ, когда существует риск нарушения центральное положение сфероида в U-образную форму и. Это может привести к неоптимальной анализа изображений, с сфероидов в различных фокальных плоскостях. Поэтому очень важно, чтобы добавить BMM осторожно и медленно, чтобы каждый хорошо. После того ВММ целесообразно проверить плитупод микроскопом и, если локализация считается неприемлемым, это может быть исправлено путем осторожного центрифугирования. С опытом, это редко. Несмотря на то, этот метод является надежным и очень воспроизводимые, в-экспериментальное изменение может произойти с различными партиями СМЛ. Чтобы избежать этого, желательно, чтобы приобрести достаточное BMM из одной партии, чтобы завершить цикл исследований. Ограничением метода (как и для любых таких анализов) является трудность в различении инвазии и пролиферации, который опухолевые клетки, скорее всего пройти во время проведения анализа кадра. Хотя время удвоения клеток может быть принято во внимание, или ингибиторы клеточного цикла, такие как цитохалазином D введена, она не так легко контролировать или четко различать эти два различных аспектов прогрессирования опухоли, особенно для быстрорастущих опухолевых клетках, и для тех, кто имеют более &quot;обширный&quot;, а не инфильтративный, вторжение шаблон. По этой причинеон предположил, что параллельно 3D анализ роста осуществляется для оценки конкретных последствий любых тормозных или стимулирующих агентов. Если исследования отклика осторожность дозы выполняются, то можно выбрать концентрации, которые минимизируют воздействие на пролиферацию. Например, мы показали, что ингибитор HSP90 17-AAG ингибирует U-87 мг 3D опухоли сфероид вторжение уже через 24 часа и при концентрациях ниже концентрации ингибирования 3D рост на 50% (GI 50) 12. С другой стороны, значение этого теста по сравнению с другими анализов стандартное инвазии (например, фильтровать на основе анализов или вторжения одиночных клеток в 3D матриксе 1), является то, что опухолевые клетки проникают в окружающую матрицу из сфероида, который напоминает &quot; микро-опухоль &quot;или&quot; микро-метастазы &quot;, и, следовательно, принимает во внимание важные аспекты патофизиологии опухолевой массы. Метод, который мы представляем предоставляет информацию околлективное поведение опухолевых клеток, когда изначально, оставляя сфероидов, а также индивидуально, когда отдельные клетки достигают более отдаленные регионы СМЛ. Кроме того, клетки в опухоли сфероидов могут возникнуть гипоксия и питательных веществ лишения, которые, через изменения в экспрессии генов, может способствовать миграции и инвазии; такие функции отсутствуют в 2D анализов. Более того, все это доступно в формате высокой пропускной посредством использования конкретных 96-а и новейших технологий обработки изображений, что позволяет более сложным 3D анализа, чтобы быть легко использован в проверке целевого и лекарственных препаратов. Метод, который мы представляем могут разместиться дополнительные приложения, чтобы удовлетворить дополнительные аспекты вторжения опухолевых клеток. В частности, дополнительные сложности могут быть предусмотрены путем добавления клетках-хозяевах, таких как фибробласты и / или эндотелиальных клеток, в самой сфероида или окружающей матрицы. Это также может быть изменен, не только с точки зрения жесткости (за счет использования различных COncentrations из СМЛ), но и с точки зрения состава (путем добавления других компонентов, зависящих от конкретной ткани / органа принятой модели опухоли: например, тенасцином для рака мозга 16 и коллагена для рака молочной железы 17). Аналогичное установка (генерация сфероидов и изображений) могут также быть приспособлены для оценки тканевой инвазии в 3D, где опухолевые сфероиды совместно культивировали с эмбриональных телец, напоминающих сложную ткань 12 или с другими органоидам соты (например, астроциты для глиомы 18 или склеп культуры для желудочно-кишечного тракта рака), но требуется дальнейшая работа для автоматизированного анализа изображений.

Классическая развитие противоопухолевый препарат в основном сосредоточены на использовании в пробирке клеточных анализов для выявления цитотоксических агентов, которые ингибируют пролиферацию опухолевых клеток и / или способствуют запрограммированной смерти клеток (апоптоза). В последнее время усилия были направлены на достижение целевых методов лечения с развитием ингибиторов лежащих в основе молекулярных причин распространения злокачественных клеток. Несмотря на впечатляющие результаты, такие агенты часто связаны с быстрым развитием лекарственной устойчивости. Учитывая, что это инвазивных и метастатический потенциал опухолевых клеток, что является ответственным за большинство случаев смерти от рака, и что рецидив болезни, часто представляет собой более агрессивный фенотип, логично также учитывать дополняют друг друга в пробирке экспериментальных моделях 1,2, чтобы идентифицировать новые агенты, которые ингибируют эти дополнительные ключевые признаки &quot;&quot; рака. Во злокачественной прогрессии, опухолевые клетки приобретаютВозможность для вторжения в окружающие ткани и / или распространению в отдаленные органы (метастазирование). Раковые клетки проникают в базальную мембрану с образованием invadopodia 3,4. Эти структуры обогащенный актиновых филаментов, определенных адгезионных белков и протеиназы и несут коллективную ответственность за подвижности опухолевых клеток и деградации внеклеточного матрикса (ЕСМ) 5. Invadopodia расширить в ECM и, как полагают, важны для вторжения опухолевых клеток, а также в Экстравазационным сосудистых каналов, облегчая гематогенным (или) распространение лимфатической и метастазирование. Современные методы стандартные для оценки опухолевых клеток вторжение в пробирке включают следующее. Transwell основе или Бойденом камеры анализы 2,6, где одноклеточных суспензий высевают на верхней части фильтра, покрытого толстым слоем ECM полученных белков. Затем клетки вторгнуться и двигаться в нижнюю камеру в ответ на химио-аттрактантов. Обычно используется ECMбелки типа коллагена, или базальная мембрана, как матрица (ВММ, например, Матригель, полученный из опухоли EHS 7), который имитирует естественный состав базальных мембран. В качестве альтернативы, основанной на фильтре Boyden камерного типа анализов 8, клетки могут быть посеяны на верхней части ECM гель (к которому может быть добавлен фибробласты), где они образуют монослой, а затем по отдельности или в совокупности вторжение в гель. Вторжение может быть измерена в терминах числа вторжения клеток и / или пройденное расстояние от поверхности геля 9. Опухолевые клетки также могут быть полностью погружены в матрицу либо в виде суспензии отдельных клеток или сфероидов - обычно размещены между двумя слоями ECM Гель позволяет клеткам вторжение из массы опухоли в окружающую матрицу 2,6,10,11. Трехмерная (3D) опухоли сфероид вторжение анализа, описанного здесь обеспечивает быстрое, автоматизированы системы вторжения, используя highlу воспроизводимым, стандартизованный метод 12 в формате 96-луночного планшета с одним сфероида на лунку. БММ добавляют непосредственно в каждую лунку, чтобы обеспечить полутвердой матрице, в которую опухолевые клетки проникают из тела сфероида. Степень инвазии опухолевых клеток контролируется с интервалом в течение 72 - 96 часов. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с существующими вторжения анализов в пробирке, упомянутых выше: опухолевые клетки организованы в 3D структуры имитируя микрорегион опухоли или микро-метастазы; опухолевые сфероиды высокой воспроизводимостью по размеру; Вторжение анализ выполняется на месте в той же пластинке, как развитие опухоли сфероида, без необходимости перемещать их для вторичных пластин; Метод, в сочетании с новейшими технологиями автоматизированного анализа изображений, позволяет как высокое содержание и высокая пропускная способность анализа вторжения опухолевых клеток. Анализ изображений проводят с помощью визуализации цитометра, который сканирует 96-луночногоплита течение 10 мин. При использовании приложения слияния, степень и скорость вторжения достигнуто либо путем одиночных клеток или путем распространения кластеров клеток из опухолевых сфероидов и проникают в матрицу может быть измерена в динамической моде. Для меньшей пропускной способности, альтернативный метод для анализа изображений представлена ​​на основе использования инвертированного микроскопа и стандартной обработки изображений.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1218">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:297px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:135px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Web address</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Corning Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">354234</td>
			<td>http://www.corning.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td style="width:161px;">Trevigen</td>
			<td style="width:135px;">3432-005-01</td>
			<td>http://www.trevigen.com 
			Keep at&#160; 4 &#176;C to&#160; prevent solidification and dispense using cooled pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultra-low attachment 96-well plate</td>
			<td style="width:161px;">Corning</td>
			<td style="width:135px;">7007</td>
			<td>http://www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">EGF</td>
			<td style="width:161px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:135px;">130-093-825</td>
			<td>http://www.miltenyibiotec.com 
			Add 100 &#181;l 1% BSA (w/v) in water to 100 &#181;g EGF. To 25 &#181;l of this, add 4,975 &#181;l RHB-A medium to give a 10 &#181;g/ml working stock. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">RHB-A medium</td>
			<td style="width:161px;">Stem Cells Inc.</td>
			<td style="width:135px;">SCS-SF-NB-01</td>
			<td>http://www.stemcellsinc.com 
			For diluting EGF</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">31966-021</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Warm in 37 &#176;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:161px;">Biosera</td>
			<td style="width:135px;">1001/500</td>
			<td>http://www.biosera.com 
			Heat at 56 &#176;C to inactivate complement before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE</td>
			<td style="width:161px;">GIBCO</td>
			<td style="width:135px;">12605</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/ 
			Cell dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:297px;">Celigo cytometer</td>
			<td style="width:161px;">Nexcelom Bioscience</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.nexcelom.com 
			Specialist equipment for image capture and analysis.&#160; Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IX70 inverted microscope</td>
			<td style="width:161px;">Olympus</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.olympus.co.uk/ 
			Used with camera for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:297px;">Retiga Exi Fast 1394 digital camera</td>
			<td style="width:161px;">Qimaging</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.qimaging.com/ 
			Attached to microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Software used to control camera and microscope for manual image capture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Image-Pro Analyzer 7.0</td>
			<td style="width:161px;">Media Cybernetics</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.mediacy.com/ 
			Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Excel 2010</td>
			<td style="width:161px;">Microsoft</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.microsoft.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Prism 6.0</td>
			<td style="width:161px;">GraphPad</td>
			<td style="width:135px;">n/a</td>
			<td>http://www.graphpad.com/ 
			Scientific graphing and statistical software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional (3d) tumor spheroid invasion assay

Вторжение окружающих нормальных тканей, как правило, считается признаком ключ злокачественной (в отличие от доброкачественных опухолей). Для некоторых видов рака, в частности (например, опухоли головного мозга, такие как глиобластомы и плоскоклеточного рака головы и шеи. - ПРГШ) это причиной тяжелой заболеваемости, и может быть опасным для жизни даже в отсутствие отдаленных метастазов. Кроме того, рак, которые рецидив после лечения, к сожалению, часто присутствует с более агрессивным фенотипа. Таким образом, существует возможность для целевой процесс вторжения в создании новых методов лечения, которые могли бы служить дополнением к стандартным антипролиферативным агентов. До сих пор эта стратегия не была затруднена из-за отсутствия надежных, воспроизводимых анализов, пригодных для детального анализа вторжения и для скрининга лекарственных средств. Здесь мы предлагаем простой способ микро-плиты (на основе форме, самоорганизации 3D сфероидов опухоли), которая имеет большой потенциал для такой ГТУумирает. Мы примером анализа платформу, используя человеческую линию клеток глиобластомы, а также модели, где ПРГШ развитие резистентности против целевой рецептор эпидермального фактора роста (EGFR ингибиторов) связано с повышенной потенциала матрицы-инвазивным. Мы также предоставляем две альтернативные методы полуавтоматической количественной: один с использованием изображений цитометр и второй, который просто требует стандартного микроскопа и изображения захват с цифрового анализа изображений.

3D опухоли сфероида вторжения оценивается с использованием простой, воспроизводимый автоматизированный способ схематически показано на рисунке 1: воспроизводимо размера опухолевых сфероидов получены путем посева клеток в ULA 96-луночных круглодонных планшетах. 4 дней сфероидов после инициации встроены в СМЛ. Это обеспечивает полутвердой структуру, в которую опухолевые клетки проникают и распространяются из сфероида. Сфероиды, расположенный в центре на базе каждую лунку и инвазии в СМЛ легко контролировать с интервалом, начиная с Т = 0 до 72 - 96 ч с использованием изображений цитометра. Это может обеспечить полностью автоматизированный анализ изображения. Примеры различных типов инвазию раковых клеток показаны на рисунках 2 -. 4 высоко злокачественной человек глиобластома (GBM) клеточной линии U-87 мг, образует плотную, сферическую 3D структуру и используется здесь для иллюстрации опухоли головного мозга, в котором локальная вторжение ключ опасным для жизниособенность. После того, как встроенный в СМЛ, клетки U-87 МГ сфероидов распространяются с типичной &quot;звездообразования&quot; вторжение рисунка 12. Опухолевые клетки в радиальном направлении в матрицу, в которой они поддерживают 3-мерную форму. Процесс следует в течение 72 ч, как показано на рисунке 2 для U-87 мг сфероидов, когда степень инвазии опухолевых клеток, деталей этих клеточных процессов и invadopodia проходящих в СМЛ ясно видно. Полностью автоматизированные анализа изображения используется изображение цитометра обеспечивает точное количественное определение опухолевых клеток вторжения с течением времени. Количественное на фиг.2, получены, как показано на рисунке 1, где автоматизированного анализа производит сегментирование вокруг клеточных выступов, простирающихся в СМЛ с U-87 мг сфероида тела. Обратите внимание, что для этой клеточной линии, сфероид тела опухоли исключается из измерения проникновения области. Иная картина в INVASион отображается плоскоклеточного головы и шеи клеточных линий рака человека. CAL S и R CAL изогенны но CAL S чувствителен к, и лицензия R устойчивы к EGFR тирозин киназ ингибиторов 14. При отсутствии EGF, ни клеточной линии захвачена в BMM (фиг.3), однако, как было увеличено содержание EGF (2,5 нг / мл), сфероиды представляется, &quot;зародыш&quot;. При более высоких концентрациях EGF (40 и 80 нг / мл) степени вторжения была уменьшена. Это согласуется с классической колоколообразной зависимости от дозы к EGF в плане вторжения, что уже сообщалось ранее 15. В 20 нг / мл EGF, палец, как выступы, экструдированные из основного корпуса лицензия R сфероидов, пока CAL S клеток были менее инвазивными после 72 ч (рис 3). Этот перепад вторжение было очевидно 48 ч после сфероиды были помещены в BMM (содержащей 20 нг / мл EGF в течение максимального различия между клеточными линиями) И самый большой после 72 часов (Рисунок 4). Эти изображения были получены с помощью быстро изображений цитометра, а для U-87 MG. Тем не менее, в этом случае, чтобы проиллюстрировать альтернативный метод, степень инвазии количественно вручную с помощью программного обеспечения для анализа изображений автономного и представлены графически (Рисунки 3 и 4). Эти результаты иллюстрируют различие между фенотипической лекарственной чувствительностью и резистентными клетками, которые могут быть использованы для скрининга соединений, которые специфически противодействуют устойчивых, инвазивного фенотипа наркотиков. <img alt="Фигура 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Рисунок 1. Схема обзор 3D опухоли сфероида вторжения анализа. Рабочий процесс показывает шаги метод предполагает в том числе представительных образов U-87 MG глиобластомы сфероидов только после встраивания в СМЛ (верхнюю панель; Т = 0) и после вторжения<html> в ВММ (нижней панели; Т = 72 ч) и без сегментации, который измеряет площадь, покрытую вторжения клеток. Бар = 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Рисунок 2. Время-курс U-87 MG глиобластомы сфероида вторжения в ВММ. U-87 MG сфероида 3D вторжения в СМЛ контролировали и количественно до 72 часов с использованием изображений цитометра. () Типичные изображения и (В) количественная оценка Вторжение опухолевых клеток показаны. Бар = 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> Re 3 &quot;SRC =&quot; / файлы / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Рисунок 3. CAL R (устойчивы) и CAL S (чувствителен) опухоли сфероида вторжения. (А) Типичные изображения и (Б) ручное определение количества EGF дозозависимым CAL R и S CAL опухоли сфероида вторжения показаны. Бар = 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> Рисунок 4. Клетки CAL R (резистентные) сфероидов более агрессивны, чем CAL S (чувствительные) опухолевых сфероидов при размещении в BММ. ​​При стимуляции EGF CAL R опухолевые сфероиды показывают более выраженную, чем вторжение CAL S. (A) Типичные изображения и (В) ручного количественное вторжения показаны. Бар = 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay at JoVE.com

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

three-dimensional-3d-tumor-spheroid-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

56.6K Views.  The Institute of Cancer Research. Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Video: Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Сфероид Пробирной для измерения TGF-β-индуцированной Вторжение

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Человека нейроэндокринной опухоли клеточных линий в качестве трехмерных моделей по изучению прав нейроэндокринные опухоли терапия

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

Сокультивирования система с Органотипической мозга Slice и 3D Сфероид клеток карциномы

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Оценка Рак яичников Сфероид Приложении и Вторжение мезотелиальной клетки в реальном времени

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Трехмерная Co-культура Модель опухолью стромы взаимодействия

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Раковая клетка Сфероид Анализ для оценки Invasion в 3D Настройка

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Трехмерная альгинат-шарик культуре человеческих клеток аденомы гипофиза

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Трехмерный культура анализа для изучения раковых клеток инвазивности и Satellite Опухоль Формирование

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Three-Dimensional Printing of a Complex Aortic Anomaly

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal symptoms. These anomalies may be associated with other congenital heart diseases. It is hard to identify the accurate anatomic vessel location from two-dimensional imaging data, such as computed tomography. As an additive manufacturing method, three-dimensional (3-D) printing can covert the acquired imaging data into 3-D physical models. This protocol describes the procedure for modeling the volumetric DICOM imaging into 3-D data and printing it as an anatomically realistic 3-D model. Using this model, surgeons can identify the vessel location of complex aortic anomalies, which is helpful for pre-operative planning and intra-operative guidance.

Here, we present a protocol to use three dimensional printed models for pre-operative planning and intra-operative reorganization of complicated vascular locations when handling a congenital aortic anomaly.

Трехмерная печать сложных аорты аномалия

Complex congenital aortic anomalies include diverse types of malformations that may be clinically asymptomatic or present with respiratory or esophageal ...