Эта работа была частично поддержана Regione Toscana и Европейским сообществом в рамках пузырьковой Eranet + Проекты СЗП и BI-TRE.

Примечание: Все концентрации золота наностержней выражаются в терминах номинальных molarities Au. Для сравнения с другими работами, обратите внимание, что 1 M Au примерно соответствует 20 мкМ золотых наностержней, в нашем случае. 1. Получение катионного золота наностержней Примечание: Метод начинается с синтеза цетримония бромида (СТАВ) -capped золота наностержней по автокаталитическому уменьшению HAuCl 4 с аскорбиновой кислотой, в соответствии с протоколом , введенной Nikoobakht др 25 и адаптированы в соответствии с Ratto и др. 26.. Затем эти золотые наностержни модифицированы для того , чтобы получить больше биосовместимостью и сродство к плазматических мембран, с помощью комбинации полиэтиленгликоля нити 10, 11, 27, 28 и четвертичные аммониевые соединения 22. <ol><li> Очищают 24 мл СТАВ-блокированы золотые наностержни на concentratioN 450 мкМ Au с помощью двух циклов центрифугирования (12000 х г, 30 мин) и декантации. Убедитесь в том, что отношение мертвого объема до первоначального объема составляет около 1/200 или ниже для всех стадий центрифугирования в этом протоколе. С помощью 500 мкМ водного СТАВ в качестве моющего раствора, и, наконец, перевести частицы в 6 мл 100 мМ ацетатного буфера при рН 5, содержащем 500 мкМ ЦТАБ и 0,005% (об / об) полисорбат 20. </li><li> Добавить 30 мкл 10 мМ водного альфа-метокси-омега-меркапто-поли (этиленгликоль) (MW ~ 5000) и оставить реагировать в течение 30 мин при 37 ° С. </li><li> Добавить 30 мкл 100 мМ (11-Mercaptoundecyl) - N, N, N -trimethylammonium бромид в диметилсульфоксиде и оставляют в покое в течение 24 ч при 37 ° С. </li><li> Затем добавляют 18 мл 0,005% (об / об) полисорбат 20 в воде и очищают эти частицы с помощью четырех циклов центрифугирования (12000 х г, 30 мин) и декантации. С помощью 0,005% (об / об) полисорбат 20 в воде в качестве моющего раствора и, наконец, передача частиц в 2,4 мл стерильного PBS при рН7.4. Окончательное номинальная концентрация золота составляет 4,5 мМ. </li></ol> 2. Загрузка мышиных макрофагах с Gold наностержней <ol><li> Используйте / макрофагального линии клеток моноцитов J774A.1 и DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 1 мМ глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина в качестве культуральной среды. Пластина 5 х 10 5 клеток в четырех чашках Петри диаметром 60 мм и позволяют им расти в течение 24 часов, с тем, чтобы быть субконфлюентные в момент отрыва (этап 2.2). <ol><li> На протяжении всего протокола, поддерживать клетки в стандартных условиях культивирования (37 ° С, 5% СО 2, 95% воздуха и 100% относительной влажности). Используйте шкаф ламинарного потока и соответствующие средства индивидуальной защиты для манипулирования клетками. </li></ol></li><li> Через 24 часа, загрузите клетки с катионными золота наностержней и подготовить их для встраивания в хитозана фильмов: <ol><li> Для того, чтобы позволять частицам поглощаться клетками, добавляют аликвоту 4,5мМ Au катионный золота нанострежни в PBS в каждую чашку Петри таким образом, чтобы достичь конечной концентрации 100 мкМ Au. Оставьте чашки Петри в инкубации в течение 24 ч. </li><li> Затем наблюдать клетки под оптическим микроскопом, чтобы подтвердить свои хорошие условия и загрузку. Клетки должны демонстрировать свою нормальную морфологию и ряд темных внутриклеточных везикул. Открепления клеток с помощью скребка, объединить те из двух чашек Петри, для достижения подходящего количества клеток для следующих стадий ( по крайней мере , 2 × 10 6 клеток), и центрифугировать их (120 XG, 6 мин) , чтобы устранить любые избыток катионных золотых наностержней. Клеточный осадок должен выглядеть почти черный. </li><li> Приостанавливать осадок в 2 мл PBS и подсчета клеток с использованием камеры Бюркера. Центрифуга суспензию , содержащую 2 х 10 6 клеток (120 XG, 6 мин) и зафиксировать их осадок в 2 мл 3,6% (вес / объем) формальдегида в PBS в течение десяти минут при комнатной температуре. И, наконец, мыть эти гранулы трижды centrifugatион (120 XG, 6 мин), для того, чтобы удалить закрепитель. Используйте PBS в качестве промывочного раствора. </li></ol></li></ol> 3. Заливка макрофагами в хитозан фильмов Примечание: Специфические свойства хитозана 26, 27, 28, 29 эксплуатируются для получения биомиметических фантомы , содержащие макрофаги окрашивали с катионными золота наностержней. Что касается других гидрогели , такие как агарозы, хитозан позволяет фильмы, которые намного сильнее и тоньше, что имеет решающее значение для PA микроскопии 6. Изготовление этих фантомов осуществляется в соответствии с предыдущими протоколами 29, 30, 31 с некоторыми изменениями , как это предписано в 30 следующих параметров . <ol><li> Готовят подкисленного (рН 4,5, полученный добавлением уксусной кислоты) и вязкую 3% (вес / объем) низкомолекулярного хитозана молекулярной (в среднем 120 МВт кДа) раствор, тщательно перемешать ипусть гомогенизируют в течение 24 ч при 40 ° С. </li><li> Затем смешать мышиные макрофаги , содержащие катионный золотые наностержни (2 х 10 6 клеток) с 500 мкл раствора хитозана. </li><li> Для того чтобы получить ~ 50 мкм фантомы, влить 250 мг смеси в 1,91 см 2 полистирольные формы и оставить их в токе азота в течение 24 ч. После этого обработать эти образцы с 500 мкл 1 М NaOH, для того, чтобы вызвать образование поперечных связей, и промойте их 10 мл сверхчистой воды. </li></ol> 4. Испытание устойчивости фотоакустическом преобразования Примечание: Стабильность преобразования PA исследована с помощью экспериментов PA с самодельной установки, которая описана в 6. <ol><li> Приостановка хитозана пленку, содержащую Макрофагов в деионизированной воде, например при помощи пластикового держателя, погруженной в чашку Петри, с тем, чтобы держать на расстоянии ~ 5 мм от нижней части пластины. Поместите эту пластину на микрометрической стадии XYс целью контроля положения образца. </li><li> Фокусировка лазерного луча с ~ длительностью 5 нс импульса в резонанс с продольной плазмонного полосы золотых наностержней (например, с помощью оптического параметрического генератора , накачиваемого третьей гармоники добротности Nd: YAG лазера с диапазоном длин волн от 400 - 2500 нм и длительностью импульса 5 нсек) перпендикулярно к поверхности пленки с диаметром пятна ~ 300 мкм. <ol><li> Поместите аттенюатор в передней части лазерного выхода для настройки плотности энергии лазерного излучения и использовать делитель луча , чтобы сфокусировать часть лазерного луча измерителя энергии (например, пироэлектрический детектор) и контролировать колебания плотности энергии. Поддерживать оптическую плотность энергии ниже ~ 1 мДж / см 2 на импульс во время выравнивания. Используйте соответствующие защитные очки для защиты от лазера, когда лазер включен. </li></ol></li><li> Dip ультразвуковой датчик (частотный диапазон 1 - 20 МГц) в чашки Петри ~ 2 мм от поверхности пленки и отрегулируйте ее положение с помощью микрометрических переводыи вращательные этапы, чтобы максимизировать сигнал PA, излучаемый из пленки. </li><li> Определение зонда плотности энергии F LO , который не повреждает образец 6: <ol><li> Облучить случайную точку образца при плотности энергии около 1 мДж / см 2 на один импульс в течение не менее 500 импульсов. Для каждого импульса, получить соответствующий сигнал PA от ультразвукового преобразователя и плотности энергии лазерного излучения от счетчика энергии с помощью осциллографа. Назовите среднюю плотность энергии как F LO суда. </li><li> Рассчитать интенсивность сигнала ПА как его амплитуды от пика до пика в зависимости от числа импульсов. Для того , чтобы противовеса флуктуации интенсивности лазерного, нормализовать амплитуду каждого сигнала ПА отношение собственного флюенса к F LO суда. Анализ тенденции нормированной интенсивности ПА в зависимости от числа импульсов и проверить его стабильность во времени. </li><li> В случае нестабильности, повторите шаги 4.4.1 4.4.3 с более низким значением F LO <s&gt; до суда. В случае стабильности, повторить их со значением F LO проб выше на ~ 10%, до тех пор пока потеря устойчивости не возникает. Установите датчик плотности потока F LO , как второй по величине значения F LO испытание , которое обеспечивает стабильность. </li></ol></li><li> Мера изменения формы пороговой дозы: <ol><li> Выбрать другой случайную точку образца и зонда средней интенсивности PA (I LO а) более 500 импульсов на F LO. </li><li> Установите номинальную плотность энергии больше , чем F LO и доставить 50 импульсов. Назовите их среднюю плотность энергии как F возб. </li><li> Зонд средней интенсивности PA (I LO б) свыше 500 импульсов на F LO еще раз. Вычислить отношение R = I LO B / I LO а. Значение R меньше единицы свидетельствует о необратимом изменению оптических свойств образца. </li><li> Используйте микрометрическое этап XY, чтобы переместить фильм и изменить POINт образца в случайном порядке. Повторите шаги 4.5.1 для 4.5.4 с различными значениями F возб, с тем, чтобы занять несколько значений R ниже, вокруг и выше единицы. 15 баллов являются разумными. </li><li> Участок R как функцию F возб и определить порог изменения формы флюенса F - го , как это значение , когда R начинает отличаться от одной за статистической неопределенности. 6 </li></ol></li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Понятие целевой опухолеассоциированных макрофаги развивается как мощная концепция борьбы с раком 34, 35, 36. Здесь, вместо их уничтожения, эти клетки вербуют в качестве клеточных транспортных средств, чтобы принести золотые наностержни в опухоль, за счет экс?...

За последнее десятилетие различные плазмонных частицы , такие как золото наностержней, нанооболочек и наноклеток, получили большое внимание для применения в биомедицинской оптики 1, 2, 3, 4. В противоречии со стандартными золотыми наносферы, эти новые частицы резонируют в окне ближней инфракрасной области спектра (NIR) , которая обеспечивает глубокой оптического проникновения через тело и самого высокого оптического контраста над эндогенными компонентами 1. Эта особенность вызвала интерес к инновационных приложений, таких как фотоакустическом (ПА) и в производстве фототермическому абляции рака. Тем не менее, ряд вопросов, сдерживать клиническое проникновение этих частиц. Например, их оптическая активация имеет тенденцию вызывать их перегрев и модифицировать их функциональные формы в сторону более сферических профилей, которые приводит в действие photoinstability 5, 6, 7, 8 </SUP&gt;, 9. Другой вопрос, который доминирует в научной дискуссии является их системная доставка в опухоли. В частности, золотые наностержни комбинировать размеры, которые идеально подходят для пронизывают опухолей, которые показывают повышенную проницаемость и удерживание и легкость сопряжения с специфическими зондами злокачественных маркеров. Таким образом, их подготовка к прямой инъекции в кровоток воспринимается как осуществимый схеме 10, 11, 12, 13. Тем не менее, этот маршрут остается проблематичным, причем большая часть частиц становится охваченными системой мононуклеарных фагоцитов 10, 11, 12. Кроме того, еще одна проблема заключается в оптический и биохимический стабильность частиц после циркуляции через корпус 14. Когда частицы теряют коллоидной стабильности и заполнитель, их плазмонных особенности и динамика теплопередачи может пострадать от плазмонного муфты 15, </sдо&gt; 16, 17 и поперечного перегрева 18. Совсем недавно, понятие эксплуатировать тропизм опухолеассоциированными макрофагов возникла как альтернатива смарт - 19, 20, 21. Эти клетки держать врожденную способность обнаруживать и пронизывают опухолей с высокой специфичностью. Таким образом, одна перспектива может быть , чтобы изолировать эти клетки от пациента, загружать их с золотыми наностержней в пробирке , а затем вводят их обратно в организм пациента, с намерением использовать их в качестве клеточных транспортных средств, отвечающих за доставку. Еще одним преимуществом было бы получить больше контроля над оптической и биохимической стабильности частиц, так как их биологический интерфейс будет построен в пробирке. Тем не менее, характеристики этих клеточных транспортных средств в качестве оптических контрастных агентов необходим критический анализ. В этой работе мы описываем подготовку и критические вопросы cellulА.Р. транспортных средств, содержащих золотые наностержни для визуализации ПА рака. ПЭГилированные золотые наностержни , модифицированные соединения четвертичного аммония 22, с тем чтобы добиться катионный профиль , который , как ожидается, способствовать их взаимодействия с плазматических мембран 23, 24. Эти частицы подвергаются эффективной и неспецифическое поглощение от большинства клеточных типов, мы надеемся, не мешая много с их биологическими функциями. Мышиные макрофаги загружены до целых 200, 000 катионных золотых наностержней на клетку, которые становятся заключены в плотных эндоцитических везикул. Эта конфигурация должна возникнуть беспокойство, из-за угрозы плазмонного сцепления и перекрестного перегрева внутри этих пузырьков. Таким образом, макрофаги встроены в биополимерных гидрогелей, которые имитируют биологических тканей, для того, чтобы убедиться, что большинство стабильности преобразования PA частиц сохраняется при переходе от ростовой среды к эндоцитических везикул. EffectivКритерии оценки электронной разработаны для того, чтобы измерить стабильность преобразования ПА в условиях непосредственный интерес для работы с изображениями PA. Перепрофилирования порог устанавливается в самом начале оптической нестабильности после череды 50 лазерных импульсов с типичной частотой повторения 10 Гц. Мы уверены в том, что эти результаты могут обеспечить импульс для разработки новых стратегий для доставки плазмонных частиц к опухолям.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6269</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gold(III) chloride trihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">520918</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silver nitrate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5960</td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium borohydride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">To synthesize gold nanoseeds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MeO-PEG-SH</td>
			<td style="width:104px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PEG1171</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods. Molecular weight about 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">320099</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods and solubilize chitosan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8750</td>
			<td style="width:321px;">To PEGylate gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">(11-Mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">733305</td>
			<td style="width:321px;">To modify gold nanorods with quaternary ammonium compounds</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">276855</td>
			<td style="width:321px;">To solubilize (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium bromide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;&#160;Polysorbate 20</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td style="width:321px;">To centrifuge PEGylated gold nanorods</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-516F</td>
			<td style="width:321px;">To suspend gold nanorods before incubation with cells and to treat pellets of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">J774a.1</td>
			<td style="width:104px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-67</td>
			<td style="width:321px;">Monocyte/macrophage murine cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE12-707F</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE14-801F</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">BE17-605E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:104px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">DE17-602E</td>
			<td style="width:321px;">To be added to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">705001</td>
			<td style="width:321px;">Cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:104px;">EuroClone</td>
			<td style="width:119px;">ES7018</td>
			<td style="width:321px;">To detach cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:104px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">47630</td>
			<td style="width:321px;">To fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chitosan, low molecular weight&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">448869</td>
			<td style="width:321px;">75-85% deacetylated. Molecular weight about 120,000 Da</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">306576</td>
			<td style="width:321px;">To insolubilize chitosan and generate the hydrogel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polystyrene cell culture plates</td>
			<td style="width:104px;">NEST</td>
			<td style="width:119px;">702011</td>
			<td style="width:321px;">Used as molds to fabricate chitosan hydrogels</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Optical parametric oscillator pumped by the third harmonic of a Q-switched Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:104px;">Continuum, Santa Clara, USA</td>
			<td style="width:119px;">&#160;Surelite OPO plus</td>
			<td style="width:321px;">Source of optical excitation for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pyroelectric detector&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Gentec, Quebec, Canada</td>
			<td style="width:119px;">QE8SP</td>
			<td style="width:321px;">To monitor optical fluence for photoacoustic tests</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Pre amplified needle hydrophone</td>
			<td style="width:104px;">Precision Acoustic, Dorset, UK</td>
			<td style="width:119px;">Model with 1 mm sensor diameter and 1-20 MHz frequency range</td>
			<td style="width:321px;">To measure photoacoustic signals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and photoacoustic analysis of cellular vehicles containing gold nanorods

Золотые наностержни являются привлекательными для ряда биомедицинских применений, таких как фототермической абляции и фотоакустическом визуализации рака, благодаря их интенсивного оптического поглощения в ближней инфракрасной области окна, низкий уровень цитотоксичности и потенциал дома в опухоли. Тем не менее, их доставки к опухоли по-прежнему остается проблемой. Инновационный подход состоит из эксплуатации тропности опухолеассоциированными макрофагов , которые могут быть загружены с золотыми наностержней в пробирке. Здесь мы опишем подготовку и Фотоакустический осмотр транспортных средств, содержащих клеточных золотых наностержней. ПЭГилированные золотые наностержни, модифицированные соединения четвертичного аммония, с целью достижения профиля катионной. При контакте с мышиными макрофагами в обычных чашках Петри, эти частицы оказываются претерпевают массовое потребление в эндоцитических везикул. Затем эти клетки встраиваются в биополимерных гидрогелей, которые используются для проверки того, что стабильность фотоакустическом преобразованиячастиц сохраняется в их включения в клеточные транспортные средства. Мы уверены в том, что эти результаты могут обеспечить новое вдохновение для разработки новых стратегий для доставки плазмонных частиц к опухолям.

Здесь, возможности сотовых транспортных средств, содержащих золото наностержни для визуализации ПА рака показана вместе с типичными результатами протокола. ПЭМ изображения на рисунке 1 показывают обычный внешний вид частиц...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods at JoVE.com

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Подготовка и Фотоакустическая Анализ клеточных транспортных средств, содержащих Gold наностержней

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

preparation-photoacoustic-analysis-cellular-vehicles-containing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K Views.  Italian National Research Council. We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Video: Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Подготовка жалобы матриц для Количественная Сотовая Сокращение

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

Изготовление Micro-тканей с использованием модулей Коллаген гель, содержащий клетки

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Изготовление образцов, Imaging, и анализ протоколов для ножа сканирующей микроскопии

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Обнаружение и изоляция циркулирующих клеток меланомы использованием Фотоакустическая флоуметрии

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Комплексная Фотоакустический Офтальмоскопия и спектрально-домен Оптическая когерентная томография

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Photoacoustic Cystography

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The risk of bladder cancers in children due to radiation exposure is more significant than many other cancers. Here we demonstrate the feasibility of nonionizing and noninvasive photoacoustic (PA) imaging of urinary bladders, referred to as photoacoustic cystography (PAC), using near-infrared (NIR) optical absorbents (i.e. methylene blue, plasmonic gold nanostructures, or single walled carbon nanotubes) as an optical-turbid tracer. We have successfully imaged a rat bladder filled with the optical absorbing agents using a dark-field confocal PAC system. After transurethral injection of the contrast agents, the rat's bladders were photoacoustically visualized by achieving significant PA signal enhancement. The accumulation was validated by spectroscopic PA imaging. Further, by using only a laser pulse energy of less than 1 mJ/cm2 (1/20 of the safety limit), our current imaging system could map the methylene-blue-filled-rat-bladder at the depth of beyond 1 cm in biological tissues in vivo. Both in vivo and ex vivo PA imaging results validate that the contrast agents were naturally excreted via urination. Thus, there is no concern regarding long-term toxic agent accumulation, which will facilitate clinical translation.

Photoacoustic cystography (PAC) has a great potential to map urinary bladders, a radiation sensitive internal organ in pediatric patients, without using any ionizing radiation or toxic contrast agent. Here we demonstrate the use of PAC for mapping urinary bladders with an injection of optical-opaque tracers in rats in vivo.

Фотоакустическая Цистография

Conventional pediatric cystography, which is based on diagnostic X-ray using a radio-opaque dye, suffers from the use of harmful ionizing radiation. The ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Получение и анализ<em&gt; In Vitro</em&gt; Трехмерное карциному груди Суррогаты

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Изготовление и характеристика фантомы оптических ткани, содержащие макроструктуры

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Подготовка, очистки и использования липосомы, содержащие жирные кислоты

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Подготовка и Фотоакустическая Анализ клеточных транспортных средств, содержащих Gold наностержней

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST