Эта работа была частично финансируется NIH R01 # DE021475 (CTM), в NIH Predoctoral Training Грант 5T32GM007127 (PAE), и НФС Graduate Fellowship (Research НАЗ). Мы благодарим Кевин Schwalbach для выполнения BAC recombineering и инъекции, Ник Donde для генерации данных секвенирования CRISPR Sanger, и Кэтрин Липари за полезную обратную связь по протоколу инъекции.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Потребители инъекционных одноклеточных колюшки эмбрионов для трансгеноза или редактирования генома представляет три основные задачи. Во-первых, по отношению к данио эмбрионов, колюшка эмбриональных хориона является жестким и часто ломаются иглы. Эта проблема может быть частично пре...

Одним из основных компонентов понимания того, как возникает биоразнообразие определения генетических и развития основ эволюционировали фенотипических изменений в природе. Трёхиглая колюшка рыбы, Gasterosteus колюшка, стала отличной моделью для изучения генетической основы эволюции. Колюшками претерпели множество адаптивных эволюционных изменений , как морские рыбы колонизировали бесчисленные среды пресной воды вокруг северного полушария, что приводит к драматическим морфологическими, физиологическими, и поведенческие изменения 1. Геномы лиц из двадцати одного населения колюшки были секвенированы и собраны, и карта связи с высокой плотностью была сформирована для дальнейшего совершенствования сборки 2,3. Генетические эксперименты картирования выявили участки генома , лежащие в основе эволюционировали фенотипов 4 - 6, а в некоторых случаях функциональные роли специфических генов - кандидатов были протестированы 7,8, Ряд геномных областей , лежащих в основе морфологических изменений были идентифицированы с многообещающими генов - кандидатов, однако эти кандидаты еще не были функционально протестированы 9 - 12. Кроме того, колюшки являются общими моделями для изучения генетики популяций / геномики 13,14, видообразования 15, поведение 1, эндокринологии 16, экотоксикологии 17, иммунология 18 и паразитологии 19. Будущие исследования в каждой из этих областей выиграют от способности выполнять функциональные генетические манипуляции в колюшки. Помимо манипулирования их кодирующих последовательностей, роли генов - кандидатов , могут быть оценены путем изучения их цис - -regulatory последовательности и функционально увеличение, уменьшение или устранение экспрессии гена - кандидата. Микроинъекция и Трансгенез методы в колюшками хорошо установлены 7,8,20 и первоначально были разработаны с использованием meganuclease-опосредованнойСпособ 21 впервые описан в оризии 22. Модифицированный метод микроинъекции, представленный здесь был оптимизирован для обоих Tol2-опосредованной трансгеноза и недавно разработанный геном редактирования реагентов, включая Таленс и CRISPRs. Изменения в цис -regulatory элементов , как полагают, иметь решающее значение для морфологической эволюции, как СНГ -regulatory изменения могут избежать негативных последствий плейотропных мутаций кодирующих 23. Таким образом, тестирование и сравнение предполагаемых цис - -regulatory последовательности стала главной целью все большего числа эволюционных исследований. Кроме того, большинство вариантов человеческих болезней являются регуляторными варианты 24,25 и системы модели позвоночных животных крайне необходимы для изучения цис -regulatory функции элемента и логики. Рыбы , которые оплодотворяют их эмбрионы внешне в большом количестве предлагают мощные системы позвоночных животных для изучения цис -regulation. Система транспозонов Tol2, в котором foreiдп ДНК должны быть интегрированы в геном примыкают Tol2 транспозаза сайты связывания и со-инъецируют Tol2 мРНК транспозазы, работает с высокой эффективностью для успешной интеграции плазмидной конструкции в геномах рыб 26 - 28. Как правило, потенциальный энхансер клонировали выше базального промотора (например, hsp70l 29) и ген флуоресцентного репортер , такой как EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) или mCherry в Tol2 позвоночнике и вводили транспозазы мРНК 26. Наблюдение экспрессии флуоресцентного репортера, либо в инъецированных эмбрионов или потомство с стабильно интегрированных трансгенов, предоставляет информацию о пространственно-временной регуляции экспрессии генов с приводом от предполагаемого энхансера. В дальнейших экспериментах, валидированные энхансеры могут быть использованы для управления тканеспецифичную избыточную экспрессию генов, представляющих интерес. Для анализа больших цис -regulatory регионов, высокого качества большого вставки геномабиблиотеки IC помощью бактериальных искусственных хромосом (БАС) были построены для морских и пресноводных колюшки 30. Эти BACs можно recombineered заменить ген с флуоресцентным репортерным геном в контексте большой (150-200 кб) геномной области 31. Флуоресцентный репортер затем выражается в пространственно-временной схеме, что определяется регуляторными последовательностями внутри БАКа. Для исследований в рыбе, сайты Tol2 могут быть добавлены к БАК , чтобы облегчить геномную интеграцию 32,33. На более поздних стадиях развития , когда гибридизация является технически сложной задачей, флуоресцентное считывание BAC может быть использован для изучения закономерностей экспрессии генов, как было показано для колюшки костного морфогенетического белка 6 (BMP6) 20. Кроме того, флуоресцентные паттерны экспрессии в личности могут быть отслежены с течением времени, которое не может быть достигнуто с гибридизация. BACs также может быть использован для добавления additionaл копию геномной области, чтобы увеличить дозировку представляющего интерес гена. Для изучения функции гена, редактирование генома является взрывным расширением поля , которое может быть использовано для получения целевых изменений геномных последовательностей в самых разнообразных организмов 34. Активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) являются модульными, последовательность конкретных нуклеазы первоначально выделенные из возбудителей болезней растений , которые могут быть точно сконструированных связываться непосредственно с геномной последовательностью выбора и генерировать двойной нити сломать 35,36. Кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) / системы CAS первоначально были найдены в бактериях и использовать направляющую РНК и белка cas9 генерировать разрыв в последовательности ДНК - мишени , комплементарной направляющей 37. Последующее ремонт двойного разрыва цепи, созданной обоими Таленс и CRISPRs часто выходит за небольшой вставки или делеции, которые могут нарушить функции последовательности-мишени35-37. В колюшками, Таленс были использованы для срыва экспрессии гена путем ориентации энхансер 20, и оба Таленс и CRISPRs успешно производят мутации в кодирующих последовательностях (неопубликованные данные). Подробный протокол для генерации CRISPRs для использования в данио рерио могут быть использованы в качестве ориентира для разработки CRISPRs для колюшками 38. Трансгенные и геномные эксперименты редактирования требуют введения нуклеиновых кислот в недавно оплодотворенного одноклеточного эмбриона. Путем введения трансгенов или геном-инструмент для редактирования на ранних стадиях развития, число генетически измененных дочерних клеток в эмбрионе максимальна. Введенный эмбрионы затем визуально обследованы на флуоресценцию или молекулярно-скрининг на модификации генома. Если клетки, способствующие зародышевой успешно целенаправленным, трансген или мутация может быть передана к подмножеству потомства, даже тогда, когда после инъекции летальность высока. Мозаичное рыба может быть ауткроссной илискрещивали и потомство их просеивают, чтобы восстановить мутантные аллели или стабильно интегрированный трансген интерес. Этот протокол описывает способы введения трансгенов и генома редактирования реагентов в эмбрионы колюшки одноклеточных и мониторинга для успешных геномных изменений.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereomicroscope with transillumination</td>
			<td style="width:145px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">S6e/ KL300 LED</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manual micromanipulator</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MM33</td>
			<td style="width:167px;">Marzhauser M33 Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Injecion system</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPPI-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Back pressure unit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">BPU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette holder kit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPIP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic base holder</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">Magnetic base</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Foot switch</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FSW</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron plate (magnetic base)</td>
			<td style="width:145px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:145px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5% phenol red in DPBS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td style="width:167px;">injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">#5 forceps, biologie dumoxel&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td style="width:167px;">for needle breaking</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">E210</td>
			<td>holds needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6&#34;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td>
			<td style="width:145px;">Lenox</td>
			<td>20571 (S636RP)</td>
			<td>hold eggs for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">13 cm x 13 cm glass plate</td>
			<td style="width:145px;">any hardware store</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&#160;</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-F4</td>
			<td style="width:167px;">*harder glass than zebrafish injection capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">150 x 15mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td>raise stickleback embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 10mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td>store eggs pre-injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean Salt</td>
			<td style="width:145px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine methanesulfonate/MS-222</td>
			<td style="width:145px;">Western Chemical Inc</td>
			<td style="width:119px;">MS222</td>
			<td style="width:167px;">fish anaesthesia/euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sp6 transcription kit</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;">For transcription of TALENs and transposase mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:167px;">purify transposase or TALEN RNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QiaQuick PCR cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td style="width:167px;">clean up plasmids for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K 20 mg/ml</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM2546</td>
			<td style="width:167px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nucleobond BAC 100 kit</td>
			<td style="width:145px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740579</td>
			<td>for BAC DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12943</td>
			<td style="width:167px;">contains endotoxin rinse buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAQuick Gel Extraction</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704&#160;</td>
			<td>for sequencing induced mutations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P2069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50X Tris-acetate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">B49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5-10KbRNA ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop&#160; Spectrophotometer</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10X PBS</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NP-40</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris pH 8.3</td>
			<td style="width:145px;">Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-strip PCR tube</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

Трёхиглая колюшка рыбы возникла как мощной системы для изучения генетической основы широкого спектра морфологических, физиологических и поведенческих фенотипов. Замечательные разнообразные фенотипы, которые развивались, как морские популяции адаптироваться к окружающей среде бесчисленных пресноводных, в сочетании со способностью пересекать морские и пресноводные формы, дают редкую позвоночное систему, в которой генетика может быть использована для сопоставления геномных областей управлени эволюционировали черты. Отличные геномные ресурсы теперь доступны, способствуя молекулярно-генетических рассечение эволюционировали изменений. В то время как эксперименты картографирования генерировать списки интересных генов-кандидатов, функциональные генетические манипуляции необходимы для проверки роли этих генов. регуляции генов могут быть изучены с трансгенными репортерных плазмид и БАС интегрированы в геном, используя систему транспозаза Tol2. Функции специфических генов - кандидатов и цис - -regulatory элементы могут быть оценены путем индукции целевыхмутации с Talen и CRISPR / cas9 редактирования генома реагентов. Все методы требуют введения нуклеиновых кислот в оплодотворенных эмбрионов колюшки одноклеточных, задача сделал сложной толстой хориона из колюшки эмбрионов и относительно небольшим и тонким бластомере. Здесь подробный протокол для микроинъекции нуклеиновых кислот в колюшки эмбрионов описано для трансгенных и редактирования генома приложений для изучения экспрессии генов и функции, а также методов оценки успешности трансгеноза и обнаружения стабильных линий.

Для гена трансгенов репортера , которые имеют энхансер активность, успешное инъекции приведет к конкретным, клеточной экспрессии трансгена (рис 4A, 4C). Введенные рыба может быть ауткроссной для получения стабильных линий ( на примере САК стабильной ли...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks at JoVE.com

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Микроинъекция для Трансгенез и редактирования генома в трехиглой колюшками

Трансгенные манипуляции и редактирования генома имеют решающее значение для функционально тестирования роли генов и цис - -regulatory элементов. Здесь подробный протокол микроинъекции для генерации геномных модификаций (в том числе Tol2-опосредованных флуоресцентных репортерных трансгенов конструкций, Таленс и CRISPRs) представлен для эмерджентное модели рыб, в трехиглой колюшки.

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

microinjection-for-transgenesis-genome-editing-threespine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.8K Views.  University of California, Berkeley.  Трансгенные манипуляции и редактирования генома имеют решающее значение для функционально тестирования роли генов и цис - -regulatory элементов. Здесь подробный протокол микроинъекции для генерации геномных модификаций (в том числе Tol2-опосредованных флуор?...

Video: Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The question of how chromatin regulators and chromatin states affect the genome in vivo is key to our understanding of how early cell fate decisions are made in the developing embryo. ChIP-Seq&#8212;the most popular approach to investigate chromatin features at a global level&#8212;is outlined here for Xenopus embryos.

Генома Снимок хроматина регуляторов и государства в<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбрионы по чип-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Мозаика данио рерио Трансгенез для функционального геномного анализа потенциальных совместных генов в опухолевых патогенеза

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Методика Целевой показатель микроинъекции к проявляющему<em&gt; Xenopus</em&gt; почки

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Идентификация критических условий для Иммуноокрашивание в гороховой тли эмбрионов: Повышение проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured устройства для оптимизированного микроинъекции и изображений личинок данио рерио

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Эффективная стратегия для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы путем изменения генома

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Микроинъекции системы в Vivo имплантации эмбриона кардиомиоцитов птичьего эмбриона

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

Яйцо Микроинъекции и эффективного спаривания для редактирования генома в Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Генерация органоидов мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в самодельных мини-биореакторах

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Микроинъекция для Трансгенез и редактирования генома в трехиглой колюшками

PLAYLIST