Name: utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures
Uploaded: 2016-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).

1. Получение 96-миРНК Плиты Примечание: Внешние края 96-луночного планшета для более склонны к испарению по сравнению с другими скважинами, таким образом, ограничить количество киРНК до 60 на 96-луночный планшет. Заполните внешних скважин с обычной средней или PBS, чтобы ограничить это. Кроме того, экран проверки обращений рекомендуется уменьшить уклоны плиты. <ol><li> Развести миРНК до 250 - 500 нг / мкл в сниженной сыворотки среде (в соответствии с рекомендациями производителя) и аликвоты по 10 мкл в соответствующие лунки планшета со сверхнизким крепления. Выполните все экраны в трех экземплярах. Примечание: Включить соответствующие ненацеливании (отрицательный) и убийства (положительный, такие как UBB и PLK1) управления миРНК в конструкции плиты, чтобы обеспечить эффективность трансфекции может быть оценена. Использование низкого крепежных пластин для миРНК работы имеет решающее значение, так как клетки будут добавлены к трансфекции смеси. Мы не можем исключать, что некоторые производители сверхнизким вложенияпластины могут иметь тонкие эффекты на сфероида роста. Таким образом, мы рекомендуем, чтобы эти испытания конечным пользователем. </li><li> Накладки с клейкими уплотнениями и хранить при температуре -20 ° C. </li></ol> 2. Обратный Трансфекция клеточной линии <ol><li> В день экрана, размораживать пластин при комнатной температуре и спина в течение 5 мин при 1000 х г, использу настольный центрифуге. Добавьте 10 мкл восстановленного сыворотки среды, содержащей оптимизированный трансфекция реагента в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Оставьте пластины в течение 15 мин для трансфекции комплексов, содержащих миРНК с образованием. Примечание: В данном исследовании использовали линию клеток рака молочной железы ВТ474 для функционального геномного скрининга (культивированные в среде DMEM высокого глюкозы (среда Игла в модификации Дульбекко), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотиками). </li><li> Trypsinize клетки должны быть экранированы (0,05% трипсина и 0,53 мМ ЭДТА), пока они не отрываются от колбы, нейтрализуют с помощью соответствующего объема клеточной линии specifIC среднего и спина в течение 5 мин при 1000 XG на настольном центрифуге, чтобы удалить трипсина. Ресуспендируют клетки с соответствующим объемом среды и определить точное количество клеток с помощью счетчика клеток. Примечание: Обычно 5000 клеток на лунку достаточны для формирования сфероида через большинство клеточных линий тестируемых. Важно, чтобы точно подсчитать клетки, как суспензии отдельных клеток для получения точных сравнений размеров. </li><li> Развести клеток 5000 клеток на 180 мкл в холодной среде (4 ° С). Примечание: Добавление восстановленных компонентов базальной мембраны матрица будет отрицательно воздействовать на эффективность трансфекции, и рекомендуется, чтобы он не используется. Оптимизация Клеточная линия для подтверждения сфероид формирования потенциала и эффективности нокдаун должны быть выполнены до экрана. </li><li> Передачи клеточной суспензии в резервуар, пипетка перемешать и добавить 180 мкл в каждую лунку 96-луночного сверхнизким крепежной пластиной, содержащей киРНК приготовленный ранее (2,1). </li><li> Centrifugе планшет при 1000 мкг в предварительно охлажденный 4 ° C центрифуге в течение 10 мин, а затем вернуться к культуре инкубаторе 37 ° C ткани. </li><li> Примечание: Ячейки будут появляться в виде мозаики в нижней части лунки. В течение следующих 12 - 24 ч клетки будут агрегировать вместе, чтобы сформировать единую сферу. </li><li> Через 24 ч наблюдения клетки образуют единый сфероида в центре скважины. Добавьте 100 мкл полной среды в каждую лунку, чтобы стимулировать рост. </li><li> Пополнять среду после трех дней. Аккуратно удалите 100 мкл среды из каждой лунки и добавляют 100 мкл свежей среды. </li><li> На 7-й день, количественно автоматизированный размер сфероида на планшет-ридере, который может количественно контролировать сфероид рост с течением времени (см раздел 3). </li><li> После определения жизнеспособности клеток с использованием люминесцентного жизнеспособности клеток краситель (см раздел 4). </li></ol> 3. Автоматизированная Image Acquisition <ol><li> Сканирование пластин на настольном, микро-и визуализации пластины цитометр на 7-й день. <ol> &lt;li&gt; Откройте программу, выберите: &#39;96 -Ну пластины &#39;, выберите соответствующий тип плиты и введите название эксперимента. Примечание: Любая дополнительная информация может быть добавлена ​​в программное обеспечение. </li><li> Выберите приложение &#39;Tumorsphere&#39;. Alter фокус так, что сфероид находится в фокусе и имеет оптимальный контраст. Примечание: Мы рекомендуем &quot;изображения фокус на основе &#39;как существенные изменения в шаровидных размеров, как ожидается. </li><li> Выберите колодцы, которые требуют сканирования и «Начать сканирование». </li><li> С помощью программного обеспечения сканера пластины, убедитесь, что маска объекта точно представляет размер сфероида. Сделайте это путем регулирования диаметра колонии, границы дилатации, минимальная толщина и точность настройки, специфичные для каждой клеточной линии проходят 11,12. Примечание: сфероида площадь будет рассчитываться с использованием программного алгоритма. Например, чтобы точно рассчитать площадь ВТ474 сфероидов, выращенных в течение семи дней отрегулировать точность до &quot;высокого&quot;d установить минимальный диаметр колонии до 200 мкм. Это должно произвести соответствующий сфероид маски представителя сфероида области. Примечание: Эти данные затем могут быть экспортированы из машины, с помощью функции экспорта, в в виде аннотированный файла данных. Дата является пластина медианный нормализуется, соединяли и анализировали либо с помощью Z-счет или строго стандартизированной средней разности (SSMD) для идентификации миРНК, которые имели статистически значимое влияние на сфероида области. </li></ol></li></ol> 4. Определение Жизнеспособность клеток <ol><li> После того, как сфероид площадь была рассчитана, определяют жизнеспособность, используя люминесцентный краситель жизнеспособности клеток. Подготовьте реагент в соответствии с инструкциями изготовителя. </li><li> Тщательно удалите 100 мкл среды из каждой лунки и добавляют 100 мкл жизнеспособности красителя. Инкубируйте пластины в течение 15 мин, затем сканирование с помощью люминесцентного считывания планшетов. Примечание: Эти данные затем могут быть экспортированы из машины, с помощью функции экспорта, в вформа аннотированный файла данных. Дата является пластина медианный нормализуется, соединяли и анализировали либо с помощью Z-счет или строго стандартизированной средней разности (SSMD) для идентификации миРНК, которые имели статистически значимое влияние на жизнеспособность сфероида. </li></ol>

<ol>
	<li>Seton-Rogers, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+the+ErbB2+receptor+and+transforming+growth+factor+beta+in+induction+of+migration+and+invasion+in+mammary+epithelial+cells.">Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Chia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+a+novel+hypoxia-regulated+marker,+carbonic+anhydrase+IX,+in+invasive+breast+carcinoma.">Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma.</a> J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).</li><li>Trastour, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha+and+CA+IX+staining+in+invasive+breast+carcinomas:+prognosis+and+treatment+outcome.">HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome.</a> Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).</li><li>Wilson, W. R., Hay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hypoxia+in+cancer+therapy.">Targeting hypoxia in cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).</li><li>Ros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metabolic+screen+identifies+6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase+4+as+an+important+regulator+of+prostate+cancer+cell+survival.">Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival.</a> Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).</li><li>Baenke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+identifies+MCT4+as+a+key+regulator+of+breast+cancer+cell+metabolism+and+survival.">Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival.</a> J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).</li><li>Schug, Z. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+synthetase+2+promotes+acetate+utilization+and+maintains+cancer+cell+growth+under+metabolic+stress.">Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress.</a> Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+is+a+bioenergetic+substrate+for+human+glioblastoma+and+brain+metastases.">Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases.</a> Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).</li><li>Comerford, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+dependence+of+tumors.">Acetate dependence of tumors.</a> Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> J Vis Exp. (99), e52686 (2015).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Maguire, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SF3B1+mutations+constitute+a+novel+therapeutic+target+in+breast+cancer.">SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer.</a> J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).</li><li>Brough, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+viability+profiles+of+breast+cancer.">Functional viability profiles of breast cancer.</a> Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).</li><li>Ferber, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3a+regulates+reactive+oxygen+metabolism+by+inhibiting+mitochondrial+gene+expression.">FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression.</a> Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).</li><li>Jensen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO3A+promotes+metabolic+adaptation+to+hypoxia+by+antagonizing+Myc+function.">FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function.</a> EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).</li><li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+cell-mediated+adhesions+in+breast+cancer+spheroids.">Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids.</a> Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).</li><li>Bitler, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+by+targeting+EZH2+methyltransferase+activity+in+ARID1A-mutated+cancers.">Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers.</a> Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).</li></ol>

Open Access fees were supported by Nexcelom Bioscience, LLC.

Трехмерные модели рака все чаще используются для оценки эффективности известных и новых соединений, которые были разработаны для селективного уничтожения раковых клеток. Раковая клетка сфероиды структуры , которые отображают условия более аналогичные тем , которые встречаются в опухолях в естественных условиях, таким образом , соединения , которые увеличили эффективность в 3D, более вероятно , чтобы иметь эффект в естественных условиях. Тем не менее, эти методы не позволяют для идентификации потенциально новых целей, которые не были предметом разработки лекарств, которые могут иметь значительную эффективность при лечении рака. Мы разработали миРНК функциональному геному подход, который позволил к прочному молчанием генов на срок до семи дней в раковых клеточных линий сфероидов. Есть несколько важных шагов к протоколу, которые требуют оптимизации перед тем экран миРНК может быть выполнена. Способность формировать воспроизводимые жизнеспособные сфероидов в больших масштабах имеет важное значение. Кроме того,ppropriate условия трансфекции должны быть тщательно оптимизированы. Мы предлагаем несколько различных испытания той реагентов трансфекции с соответствующим ненацеливании и убивая контроля до попытки экрана. Нам удалось показать, что несколько часто используемых клеточных линий рака молочной железы, а именно ВТ474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 и JIMT1 поддавались миРНК трансфекции. Кроме того, мы обеспечиваем проверка и подтверждение принципа действия данных скрининга 200 наиболее часто мутантных генов при раке молочной железы в ВТ474 сфероидов, подтвердили свою зависимость от амплификации HER2 и онкогенных мутаций PIK3CA. Интересно отметить, что глушение фактора транскрипции FOXO3 привело к уменьшению размеров сфероида, но не оказывает существенного влияния на жизнеспособность. FOXO3 , как известно, регулируют ответ на гипоксию, изменяя метаболическую способность раковых клеток , позволяя им адаптироваться с большей готовностью к их среде 16. Эта роль может потенциально мешать чтению жизнеспособности клеток, как он обнаруживает АТФ изобилие, Одним из основных продуктов клеточного метаболизма. В поддержку наблюдения уменьшение сфероид размера, было показано , что глушение FOXO3 в HeLa ксенотрансплантатов ослабленный рост опухоли и индуцированный апоптоз 17. Важно отметить, что некоторые гены могут влиять на способность раковых клеток, чтобы сохранить их 3D архитектуру, которая может привести к ложных срабатываний. Например, нокдаун E-кадгерина привело к роспуску структуры сфероида ВТ474. Это уже сообщалось ранее , используя E-Cadherin целевых антител 18. Как и с любой скрининговой платформы, потенциальные цели должны быть снова просеивают с целью оценки воспроизводимости наблюдаемого эффекта. Существуют ограничения на технику, а именно переходного характера миРНК-опосредованной гена нокдаун. Устойчивые глушителей больше, чем за семь дней не было достижимо с миРНК. Преимущество этого подхода состоит в том, что она может быть соединена с различными другими биомуческие красители не только те, которые оценивают жизнеспособность сфероид, например, давая пространственную информацию о сфероида гипоксии или мониторинга клеток, подвергающихся апоптозу. К тому же, так как сканирование планшет-ридер относительно быстрый и неинвазивный, влияние киРНК на сфероид размера может быть оценена в течение долгого времени, а не только на экспериментальной конечной точке. Действительно, мы в настоящее время изучают некоторые из этих проспектов в рамках нашего скрининга трубопровода. Альтернативный подход, который использует 3D культур для идентификации новых зависимостей является использование химических библиотек, ингибирующих либо широкий круг задач или конкретных семейств белков. В самом деле, Bitler и др. использовали этот целевой подход для идентификации синтетического взаимодействия летальности между статусом ARID1A и ингибиторов Ezh2 в яичниках четких карцином 19. Открытие технологии редактирования гена CRISPR-cas9 также позволило для развития генетических экранов в Органоид культурах , так и в естественных условиях. Тем не менее, тего подход зависит от наличия соответствующих технических средств животного происхождения и могут стоить непомерно 20. В заключение, мы считаем , что мы наметили протокол , который более точно моделирует кислорода и питательных градиенты, которые являются особенности микросреды опухоли в естественных условиях, что позволяет для идентификации новых мишеней рака или надежной проверки установленных целевых показателей . Кроме того, наш протокол может быть применен к любому типу клеток линии, образующей сфероиды и, следовательно, может быть, которые обычно используются в научно-исследовательском сообществе рака высопроизводительный экранов киРНК.

Солидные опухоли отображать значительное гистологическое, генетические и микро-экологическая гетерогенность внутри опухоли, которая представляет клиницистам серьезную проблему в возможность успешно лечить пациентов. Большинство моделей, используемых для идентификации новых целевых терапии не учитывают многие из этих функций. Действительно, в настоящее время целевой терапии, используемые в клинике, были разработаны в последнее десятилетие с использованием скрининговых подходы, которые основываются на линиях раковых клеток, выращенных в двумерных условиях (2D) культуры. Хотя это привело к различным успехам, такие как ингибиторы рецептора тирозинкиназы, становится очевидным , что более сложные модели рака необходимо в полной мере оценить все способствующие факторы , которые управляют туморогенез в естественных условиях и увеличению числа новых методов лечения , которые делают переход от доклинических моделей для клинических испытаний. Кроме того, теперь хорошо понятно , что системы культуры 2D не отражают вVivo поведение 1,2. Например, в плохо васкуляризируется опухолей, так как спрос на кислород и питательные вещества в микросреде опережать предложение, регионы высоких и низких поставок развиваться. Наличие низкого уровня содержания кислорода (гипоксия) в опухолях, которая была определена иммуногистохимического окрашивания опухолевых участков для установленных маркеров гипоксических , таких как карбоангидразы IX (CAIX), коррелирует с худшим клиническим исходом при раке молочной железы 3,4 Таким образом , содержащего признаки , такие как гипоксия в модели скрининга может улучшить нашу способность обнаружить новые цели наркотиков , которые будут более эффективными в естественных условиях. Действительно, успешно таргетингом агрессивные опухоли , которые содержат гипоксию является клиническим приоритетом 5. Изменяющий традиционного скрининга 2D миРНК, в попытке более точно резюмировать элементы условий, с которыми сталкиваются раковых клеток в опухоли микроокружения, привело к идентификации некоторых генов-гопри было установлено, что важное значение для роста опухоли в естественных условиях. Они включают в себя функциональные геномные экраны , выполненные в условиях низких сывороточных 6, 7 условиях гипоксии и в комбинации 8. Например, глушение 6-фосфофрукто-2-киназа / фруктоза-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), белка, ответственного за регулирование углерода ввод гликолиза, только индуцируется апоптоз в линиях рака предстательной железы, полученных из метастаза при выращивании в условиях низкой сыворотке. Сайленсинг PFKFB4 в нормальных клеточных линиях простаты при тех же самых условиях , не имели никакого эффекта, в то время как, истощение PFKFB4 полностью абляции рост линии клеток рака простаты ксенотрансплантатов 6. В расширенной панели линий клеток рака молочной железы, замалчивании моно-карбоксилазы транспортером 4 (MCT4) преимущественно приводило к уменьшению роста клеточной линии в условиях пониженного содержания кислорода. Эта уязвимость была подтверждена в естественных условиях при раке молочной железы клеточной линии ортотропного xenograFTS. Пожалуй, наиболее ярко, глушителей из Ацетил-КоА синтетазы 2 (ACSS2), фермент, ответственный за преобразование ацетата в ацетил-КоА, снижается рак количество клеток при питательных условиях стресса (с низким содержанием кислорода и сыворотки), но не имели практически никакого эффекта при нормальных условиях культивирования 8. Абляция ACSS2 повлияло на рост рака молочной железы и рака простаты ксенотрансплантатов , предполагающих , что градиенты питательных веществ не существует в изоляции в пределах микросреды опухоли и клетки , которые находятся в этих областях имеют важное значение для развития опухоли 8. Кроме того, ACSS2 было также установлено, что важную роль в глиобластомы и гепатоцеллюлярной карциномой 9,10, предполагая , что повышение активности ACSS2 в опухолях может быть фундаментальным механизмом , который поддерживает рост при неблагоприятных условиях. В совокупности эти исследования доказывают , что перепросмотр условия , встречающиеся в естественных условиях и выполнения экранов миРНК позволяет для идентификации гены, необходимые для выживания рака. А также влияет 2D рост раковых клеток при питательных условиях стресса, истощения генов - мишеней в этих исследованиях ингибирует рост рака сфероид клеточной линии, отражая то , что наблюдалось в ксенотрансплантатов 6,8. Таким образом, линии раковых клеток сфероиды содержат некоторые из условий, встречающихся в микросреды опухоли, которые придают чувствительность к ACSS2 глушителей. Действительно, сфероиды отображать градиенты питательных веществ (сыворотка и кислорода), изменения рН, трехмерные (3D) межклеточных контактов, но и изменения в пролиферативной быстроты с клетками, проходящих остановку клеточного цикла и апоптоза. Примером этого может служить наличие в раковых сфероидов некротических областей, функция не найдена в традиционном 2D культуре. раковая клетка сфероиды уже использовались в качестве более биологически соответствующих моделей для скрининга ингибиторов молекулы небольших, но это позволяет только для проверки соединения эффективности или перепрофилирования из компоunds изначально дизайн для других заболеваний 11. Современные методы скрининга сфероид не позволяют для анализа конкретного гена истощения в высокой пропускной способности высокого содержания способом. Здесь мы описываем впервые, функциональная геномика трубопровод для раскрытия конкретных зависимостей генов с использованием технологии малых интерферирующих РНК (киРНК) в раковых сфероидов клеточной линии. Мы разработали сделанную на заказ библиотеку с миРНК, направленных на 200 наиболее часто мутантных генов в раковых опухолей молочной железы человека и оценили влияние истощения гена на сфероида размера и метаболической активности в ВТ474 рака молочной железы сфероидов. Мы были в состоянии решительно и воспроизводимо обнаруживать влияние ERBB2 и PIK3CA глушителей в 3D культурах. Кроме того, мы могли бы оценить влияние истощения гена на пространственной архитектуры ВТ474 сфероидов с использованием иммуногистохимии.

<table><tbody><tr><td>Lullaby</td><td>Oz Biosciences</td><td>LL70500&amp;nbsp;</td><td>lipid-based transfection reagent</td></tr><tr><td>Viromer</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td>virus-like polymer transfection reagent</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment plate</td><td>Corning</td><td>CLS7007</td><td>96 well plate</td></tr><tr><td>Foil plate seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Luminescent cell viability dye</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>CellTitre-Glo</td></tr><tr><td>Pipette tips (200 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1, 000 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (10 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>GIBCO</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Feta bovine serum</td><td>GIBCO</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>Cherry picked library</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5</td><td>Perkin Elmer</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert Inverted brightfield microscope</td><td>Zeiss</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Incubator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mulitichannel pipette</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures

Идентификация функциональных событий водителя при раке имеет решающее значение для углубления нашего понимания биологии рака и необходимым условием для открытия следующего поколения новых мишеней для лекарственных средств. Становится очевидным , что более сложные модели рака необходимо в полной мере оценить все способствующие факторы , которые управляют туморогенез в естественных условиях и повышает эффективность новых видов лечения , которые делают переход от доклинических моделей для клинических испытаний. Здесь мы представляем методологию для формирования однородных и воспроизводимых опухолевые сфероиды, которые могут быть подвергнуты миРНК функционального скрининга. Эти сфероиды отображать много характеристик, которые найдены в солидных опухолях, которые не присутствуют в традиционной двухмерной культуры. Покажем, что несколько часто используемых клеток рака молочной железы линии поддаются этому протоколу. Кроме того, мы обеспечиваем проверка и подтверждение принципа действия данных, использующих рака молочной железы клеточной линии ВТ474, подтверждающие ихзависимость от усиления рецептора эпидермального фактора роста HER2 и мутации фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата-3-киназы (PIK3CA) при выращивании в качестве опухолевых сфероидов. И, наконец, мы можем дополнительно исследовать и подтвердить пространственное воздействие этих зависимостей с использованием иммуногистохимии.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

utilizing-functional-genomics-screening-to-identify-potentially-novel

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.3K Views.  The Institute of Cancer Research. Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Video: Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated cancer associated fibroblasts are a key component of the tumor stroma that interact with cancer cells and support their growth and survival. Models that recapitulate the interaction of cancer cells and activated fibroblasts are important tools for studying the stromal biology and for development of antitumor agents. Here, a method is described for the rapid generation of robust 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and activated pancreatic fibroblasts that can be used for subsequent biological studies. Additionally, described is the use of 3D spheroids in carrying out functional metabolic assays to probe cellular bioenergetics pathways using an extracellular flux analyzer paired with a spheroid microplate. Pancreatic cancer cells (Patu8902) and activated pancreatic fibroblast cells (PS1) were co-cultured and magnetized using a biocompatible nanoparticle assembly. Magnetized cells were rapidly bioprinted using magnetic drives in a 96 well format, in growth media to generate spheroids with a diameter ranging between 400-600 &#181;m within 5-7 days of culture. Functional metabolic assays using Patu8902-PS1 spheroids were then carried out using the extracellular flux technology to probe cellular energetic pathways. The method herein is simple, allows consistent generation of cancer cell-fibroblast spheroid co-cultures and can be potentially adapted to other cancer cell types upon optimization of the current described methodology.

Here, a method is described for the preparation of 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and fibroblasts, followed by measurement of metabolic functions using an extracellular flux analyzer.

Подготовка и метаболических Assay 3-мерной сфероида Сопредседатель культур клеток поджелудочной железы и фибробластов

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

Поколение высокопроизводительных трехмерных опухоли сфероидов для скрининга наркотиков

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Роботизированная Производство раковой клетки сфероидов с водной двухфазной системе для тестирования на наркотики

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Bioengineering

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

Создание 3-мерных сфероидов из образцов опухолей, полученных от пациентов, и оценка их чувствительности к лекарствам

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

Генерация 3D-опухолевых сфероидов для исследований по оценке лекарственных средств

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Скрининг на уровне генома для выявления и сравнения терапевтических мишеней в опухолях

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1), MPNSTs are the most common malignancy and the leading cause of death. These rare and aggressive soft-tissue sarcomas offer a stark future, with 5-year disease-free survival rates of 34-60%. Treatment options for individuals with MPNSTs are disappointingly limited, with disfiguring surgery being the foremost treatment option. Many once-promising therapies such as tipifarnib, an inhibitor of Ras signaling, have failed clinically. Likewise, phase II clinical trials with erlotinib, which targets the epidermal growth factor (EFGR), and sorafenib, which targets the vascular endothelial growth factor receptor (VEGF), platelet-derived growth factor receptor (PDGF), and Raf, in combination with standard chemotherapy, have also failed to produce a response in patients. 
In recent years, functional genomic screening methods combined with genetic profiling of cancer cell lines have proven useful for identifying essential cytoplasmic signaling pathways and the development of target-specific therapies. In the case of rare tumor types, a variation of this approach known as cross-species comparative oncogenomics is increasingly being used to identify novel therapeutic targets. In cross-species comparative oncogenomics, genetic profiling and functional genomics are performed in genetically engineered mouse (GEM) models and the results are then validated in the rare human specimens and cell lines that are available. 
This paper describes how to identify candidate driver gene mutations in human and mouse MPNST cells using whole exome sequencing (WES). We then describe how to perform genome-scale shRNA screens to identify and compare critical signaling pathways in mouse and human MPNST cells and identify druggable targets in these pathways. These methodologies provide an effective approach to identifying new therapeutic targets in a variety of human cancer types.

Автор в центре внимания: Поиск новых терапевтических мишеней для злокачественной опухоли оболочки периферических нервов с помощью скрининга шРНК в масштабе генома 

We have developed a cross-species comparative oncogenomics approach utilizing genomic analyses and functional genomic screens to identify and compare therapeutic targets in tumors arising in genetically engineered mouse models and the corresponding human tumor type.

Генетическое профилирование и скрининг отсева на уровне генома для выявления терапевтических мишеней в мышиных моделях злокачественной опухоли оболочки периферических нервов

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST