This work has been financially supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (No. 25248027 to M.S.).

1. Подготовка образцов <ol><li> Очистка температуры реагирующих мономеров <ol><li> Растворить 20 г N -isopropylacrylamide (ПННА) в 100 мл толуола. </li><li> Фильтр решение под вакуумом для удаления пыли. </li><li> Смешайте фильтрат 500 мл петролейного эфира. </li><li> Поместите реакционный сосуд в водяную баню со льдом. </li><li> Раствор перемешивают до тех пор, пока мономеры осаждаются (обычно 30 мин). </li><li> Фильтр решение при отсасывании, получая осажденных мономеров. </li><li> Сушат мономеры при пониженном давлении (100 Па) в течение ночи. </li></ol></li><li> Приготовление раствора полимера температуры реагирующих <ol><li> Дега 20 мл деионизированной воды в течение 1,0 мин с использованием мембранного насоса. </li><li> Растворить 780,8 мг очищенного NIPA в 9,5 мл дегазированной и деионизированной воды. </li><li> Поместите реакционный сосуд в водяную баню со льдом. </li><li> Щит реакциюсвет, покрывая устройство с алюминиевой фольгой. </li><li> Раствор перемешивают осторожно в течение 10 мин при введении умеренный поток газа Ar мягко через кончик пипетки, прикрепленного к газовому баллону с трубкой. </li><li> Добавить 11,9 мкл N, N, N &#39;, N&#39; тетраметилэтилендиамина к решению с помощью микропипетки. </li><li> Раствор перемешивают в течение 1,0 мин при введении газа Ar, как уже упоминалось в пункте 1.2.5. </li><li> При перемешивании образца, растворяют 4,0 мг персульфата аммония в 0,5 мл дегазированной и деионизированной воды. </li><li> Смешайте раствор образца (со стадии 1.2.7) и раствора персульфата аммония (со стадии 1.2.8). </li><li> Раствор перемешивают в течение 30 секунд при введении газа Ar, как уже упоминалось в пункте 1.2.5. </li><li> Накройте решение с алюминиевой фольгой и держать его в холодильнике (4 ° C) в течение ночи. </li></ol></li><li> Подготовка образцов монтирует <ol><li> Поместите 60 мкл раствора образца (отшаг 1.2.11) в слайде полости. </li><li> Накройте решение с круглой покровным стеклом. Будьте осторожны, чтобы не пузырьки воздуха ловушку. </li><li> Удалите излишки раствора с помощью микропипетки и лабораторные салфетки. </li><li> Печать образца с клеем. Пусть клей сохнуть при комнатной температуре (как правило, 6 ч). </li><li> Подготовьте еще один слайд, заполненный 0,1% вес полистирола латекса (100 нм) диаметра частиц суспензии следующие шаги 1.3.1-1.3.4. Этот слайд используется в качестве стандарта. </li></ol></li></ol> 2. Измерение размера частиц с динамического рассеяния света микроскопа <ol><li> Оптимизация инструмента <ol><li> Поместите полистирол суспензия латекса слайд (со стадии 1.3.5) на предметный столик инверсионного микроскопа. Боковая крышка стекла должна быть обращена вниз. </li><li> Поместите заслонку луча в передней части детектора (в лавинный фотодиод и автокоррелятора). </li><li> Нанесите лазерный луч (твердотельный лазер, λ = 488 нм, 30 мВт, непрерывноеволна) к образцу через линзы объектива (10 ×). Часть отраженного света проходит через зеркало запуска микроскопа и наблюдают с помощью ПЗС - камеры , установленной на боковой порт микроскопа (рисунок 1). </li><li> Отрегулируйте высоту объектива, чтобы установить фокус на образце суспензии путем сдвига высоты объектива от низкого до высокого положения. Во время этой процедуры, отраженное изображение сфокусировано три раза: на поверхности покровного стекла, на границе раздела между покровным стеклом и образцом, а на границе раздела между образцом и дырочного предметное стекло. Установить фокальную точку между вторым и третьим пункта. </li><li> Ослабление интенсивности рассеянного света, изменяя мощность лазера. </li><li> Введем рассеянного света в детекторе путем удаления заслонку луча перед детектором. Данное устройство измеряет время корреляции интенсивности света. </li><li> Установите обскуры (ф = 50 мкм) betwееп микроскоп и детектор для достижения конфокальной эффекта. Отрегулируйте положение пинхол, чтобы максимизировать интенсивность света на детекторе. </li><li> Измеряют временной корреляционной функции интенсивности рассеянного света в течение 30 с при инициации работы коррелятора с помощью компьютера. Измеренная функция корреляции часто выражается в г (2) (т) - 1, где Т время корреляции 4 и <img alt="Уравнение 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq1.jpg" /> , Здесь я (т) является интенсивность рассеянного света в момент т и (•••) T время усреднения. Время распада будет составлять около 0,1 мс. </li><li> Регулировка фокальной точки для получения широкого диапазона значений начальной амплитуды временной корреляционной функции (г (2) (т = 0) - 1). Примечание: Начальная амплитуда сильно зависит от количества отраженного света. Перемещая координирующим паклюARD интерфейс между покровным стеклом и образцом, количество отраженного света возрастает. Для сильных световых рассеивателей, таких как полистирол латекс, начальная амплитуда может быть изменен от 0 до 1. Тем не менее, трудно установить начальную амплитуду, близкую к 1 для более распространенных растворов полимеров, так как интенсивность отраженного света намного больше, чем что рассеянного света. </li><li> Применение обратного преобразования Лапласа ( с помощью ограниченного упорядочению программы CONTIN 13,14) к полученной временной корреляционной функции для получения функции распределения частиц по размерам. В тех случаях, когда начальная амплитуда устанавливается меньшим, чем 0,2, функция распределения гидродинамического радиуса покажет резкий пик около 100 нм, что в два раза превышает фактический радиус (см обсуждение для подробностей). </li></ol></li><li> измерение образца <ol><li> Установите температуру стадии до 25 ° C. </li><li> Поместите слайд, подготовленный с поли-NIPA (PNIPA) Solutион (этап 1.3.4) на столик микроскопа. </li><li> Мера времени функции корреляции интенсивности рассеянного света, выполнив шаги 2.1.4-2.1.8. Если начальная амплитуда больше, чем 0,2, отрегулировать фокусировку, чтобы сделать начальную амплитуду временной корреляционной функции менее 0,2 с шага 2.1.9. Небольшая начальная амплитуда упрощает анализ. </li><li> Установите температуру стадии до 35 ° C и подождать, пока раствор не станет мутным. Температура ниже критического раствора (НКТР) из PNIPA раствора составляет 32 ° C 15. </li><li> Мера временной корреляционной функции с помощью следующих шагов 2.1.4-2.1.8. Если это возможно, отрегулировать положение фокальной точки, чтобы сделать начальную амплитуду временной корреляционной функции меньше, чем 0,2. Для мутных растворов, их начальные амплитуды имеют тенденцию к увеличению, так как интенсивность рассеянного света увеличивается в то время как отраженного света остается постоянной. </li><li> Применить обратное Лапласа transformatiна полученных временных корреляционных функций для получения функции распределения по размерам. Обратите внимание, что фактический размер составляет половину полученное значение в тех случаях, когда начальная амплитуда меньше, чем 0,2. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hiroi, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Light+Scattering+Microscope%3A+Accessing+Opaque+Samples+with+High+Spatial+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Dynamic Light Scattering Microscope: Accessing Opaque Samples with High Spatial Resolution.</a> Opt. Express. 21, 20260-20267 (2013).</li>
<li>Barth, H. G., Flippen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+Size+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Particle Size Analysis.</a> Anal. Chem. 67, 257-272 (1995).</li>
<li>Liu, Y., Wang, Z., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supramolecular+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Characterization of supramolecular polymers.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 5922-5932 (2012).</li>
<li>Berne, B. J., Pecora, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerne%2C+BJ+%22Dynamic+Light+Scattering+with+Applications+to+Chemistry%2C+Biology+and+Physics%22">Dynamic Light Scattering with Applications to Chemistry, Biology and Physics</a>. , Dover Publications, Inc. (2000).</li>
<li>Phillies, G. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+demonstration+of+ruultiple-scattering+suppression+in+quasielastic-light-scattering+spectroscopy+by+homodyne+coincidence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+A%22%5BJournal%5D)">Experimental demonstration of ruultiple-scattering suppression in quasielastic-light-scattering spectroscopy by homodyne coincidence techniques.</a> Phys. Rev. A. 24, 1939-1943 (1981).</li>
<li>Phillies, G. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+multiple+scattering+effects+in+quasielastic+light+scattering+by+homodyne+crosscorrelation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Suppression of multiple scattering effects in quasielastic light scattering by homodyne crosscorrelation techniques.</a> J. Chem. Phys. 74, 260-262 (1981).</li>
<li>Ishii, K., Yoshida, R., Iwai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-scattering+spectroscopy+for+extremely+dense+colloidal+suspensions+by+use+of+a+low-coherence+interferometer%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-scattering spectroscopy for extremely dense colloidal suspensions by use of a low-coherence interferometer.</a> Opt. Lett. 30, 555-557 (2005).</li>
<li>Xia, H., Ishi, K., Iwai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Radius+Sizing+of+Nanoparticles+in+Dense+Polydisperse+Media+by+Low-Coherence+Dynamic+Light+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Radius Sizing of Nanoparticles in Dense Polydisperse Media by Low-Coherence Dynamic Light Scattering.</a> Jpn. J. Appl. Phys. 44, 6261-6264 (2005).</li>
<li>Maret, G., Wolf, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+light+scattering+from+disordered+media.+The+effect+of+brownian+motion+of+scatterers%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Multiple light scattering from disordered media. The effect of brownian motion of scatterers.</a> Z. Phys. B. 65, 409-413 (1987).</li>
<li>Pine, D. J., Weitz, D. A., Chaikin, P. M., Herbolzheimer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusing+wave+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Diffusing wave spectroscopy.</a> Phys. Rev. Lett. 60, 1134-1137 (1988).</li>
<li>Cerbino, R., Trappe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Dynamic+Microscopy%3A+ProbingWave+Vector+Dependent+Dynamics+with+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential Dynamic Microscopy: ProbingWave Vector Dependent Dynamics with a Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 108, 188102(2012).</li>
<li>Lu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Concentrated%2C+Multiply+Scattering%2C+and+Actively+Driven+Fluorescent+Systems+with+Confocal+Differential+Dynamic+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterizing Concentrated, Multiply Scattering, and Actively Driven Fluorescent Systems with Confocal Differential Dynamic Microscopy.</a> Phys. Rev. Lett. 108, 218103(2012).</li>
<li>Provencher, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+constrained+regularization+method+for+investing+data+represented+by+linear+algebraic+or+integral+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Phys.+Comm%22%5BJournal%5D)">A constrained regularization method for investing data represented by linear algebraic or integral equations.</a> Comp. Phys. Comm. 27, 213-227 (1982).</li>
<li>Provencher, S. W., Stepanek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+dynamic+light+scattering+autocorrelation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Part.+Syst.+Charact%22%5BJournal%5D)">Global analysis of dynamic light scattering autocorrelation functions.</a> Part. Part. Syst. Charact. 13, 291(1996).</li>
<li>Takata, S., Norisuye, T., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+Neutron+Scattering+Study+on+Preparation+Temperature+Dependence+of+Thermosensitive+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Small-angle Neutron Scattering Study on Preparation Temperature Dependence of Thermosensitive Gels.</a> Macromolecules. 35, 4779-4784 (2002).</li>
<li>Pusey, P. N., van Megen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Light+Scattering+by+Non-Ergodic+Media%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic Light Scattering by Non-Ergodic Media.</a> Physica A. 157, 705-741 (1989).</li>
<li>Chu, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+B+%22Laser+Light+Scattering.+2nd+Ed%22">Laser Light Scattering. 2nd Ed</a>. , Academic Press. (1991).</li>
<li>Shibayama, M., Tanaka, T., Han, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Angle+Neutron-Scattering+Study+on+Poly%28N-Isopropyl+Acrylamide%29+Gels+near+Their+Volume-Phase+Transition-Temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Small-Angle Neutron-Scattering Study on Poly(N-Isopropyl Acrylamide) Gels near Their Volume-Phase Transition-Temperature.</a> J. Chem. Phys. 97, 6829-6841 (1992).</li>
<li>Tanaka, T., Sato, E., Hirokawa, Y., Hirotsu, S., Peetermans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+Kinetics+of+Volume+Phase+Transition+of+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Critical Kinetics of Volume Phase Transition of Gels.</a> Phys. Rev. Lett. 55, 2455-2458 (1985).</li>
<li>Hiroi, T., Ata, S., Shibayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+of+Aggregation+States+for+Concentrated+Carbon+Nanotube+Dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Transitions of Aggregation States for Concentrated Carbon Nanotube Dispersion.</a> J. Phys. Chem. C. 120, 5776-5782 (2016).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

Начальная амплитуда временной корреляционной функции в значительной степени зависит от фокальной точки, как показано на рисунке 2 (а). Это , казалось бы , противоречит тому , что раствор однороден (для тонкого слоя на границе раздела фаз , за исключением) 8. Это изменение в начальной амплитуды объясняется изменением количества отраженного света. Частичная теория гетеродина 16 предсказывает , что начальная амплитуда, А, рассеянный свет интенсивности, я с, и интенсивность отраженного света, я г, удовлетворяют следующему уравнению 1 <img alt="Уравнение 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq2.jpg" /> Это уравнение показывает , что чем больше я г становится, тем меньше А становится. Таким образом, А снижается путем установки фокальное положение , близком к интерфейсу. Кажущаяся константа диффузии D A чап быть получена путем подгонки временной корреляционной функции в случае монодисперсных решений: <img alt="Уравнение 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq3.jpg" /> где <img alt="Уравнение 4" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq4.jpg" /> , Здесь п показатель преломления растворителя (воды, 1,33), θ является рассеянное угол (180 °), и λ является длина волны света (514,5 нм). Так как мы использовали геометрия рассеяния, значение Q фиксируется. Тем не менее, эта точка решается с использованием различных длин волн света. Пожалуйста, обратите внимание, что любой вид лазерного источника непрерывного излучения можно построить DLS микроскоп. Благодаря небольшому объему облучаемой, коэффициент 17 когерентности, по оценкам, более чем 0,99 и незначительна. Для полидисперсных растворов, функция распределения D А получается с помощью обратного преобразования Лапласа. Частичные гетеродинный йeory также предсказывает , что D A не совпадает с фактической константы диффузии D. Эти две константы диффузии удовлетворяют следующему уравнению: <img alt="Уравнение 5" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq5.jpg" /> Константа диффузии D превращается в гидродинамический радиус R H , используя уравнение Эйнштейна-Стокса 4. При А = 1, эта зависимость становится D A = D. В этом случае, процесс преобразования данных является такой же, как для общего динамического рассеяния света. Красная линия показано на рисунке 2 (б) соответствует этому случаю. В противоположность этому , эта связь становится D A = 0,5 D в пределе → 0. Таким образом, размер, по оценкам, в два раза больше фактического размера , когда А мало (практически, менее чем 0,2), как показано в синяя линия на рис 2 (б) </sЧонг&gt;. Если мы знаем , что значительно мала, горизонтальная ось может быть смещена, как показано на рисунке 2 (с). В принципе, мы можем преобразовать D A в D для любого значения A. На практике, однако, лучше , чтобы установить начальные амплитуда меньше , чем 0,2, так как простое приближение D A ~ 0,5 D справедливо. Видные особенности динамического светового микроскопа методом рассеяния были продемонстрированы с использованием раствора PNIPA. Конформации PNIPA ниже и выше НКТР была тщательно изучена с помощью малоуглового рассеяния нейтронов 15,18. В противоположность этому , динамическое рассеяние света не был использован для анализа PNIPA выше НКТР из - за его помутнению 19. Эта задача решается с помощью динамического рассеяния света микроскопа, как показано на рисунках 3 (а) и (б). Размер этих агрегатов составляет несколько &amp;# 181; м, которые не могут быть получены либо малоуглового рентгеновского рассеяния нейтронов / или обычными методами светорассеяния. С временным разрешением измерений с использованием этой системы дают информацию о процессе агрегации при изменении температуры. Недостатком динамического рассеяния света микроскопа также показано на рисунке 3. Для получения результата ниже НКТР, корреляционная функция времени сильно зависит от очень небольшого количества пыли настоящее время (черные линии на рисунке 3). Например, корреляционная функция времени не затухает полностью, даже с временами корреляции в порядке 1,0 с. Это происходит потому, что объем облучаются этим аппаратом (приблизительно 1,0 мкм), значительно меньше, чем у облученного с обычным динамическим устройством рассеяния света (приблизительно 100 мкм). В тех случаях, когда интенсивность рассеянного света слабый, сигнал затемняется шума, вызванного, например, с помощью Sмола количества пыли в растворе. Таким образом, три пика , показанные на рисунке 3 (б) не может иметь количественное значение , хотя общий порядок размера имеет смысл. Следует отметить, что такой слабый рассеиватель может быть измерена с помощью обычного динамического светорассеяния аппарата. Мы показали, что динамическое рассеяние света микроскоп позволяет нам измерять как прозрачные, так и мутные образцы с такой же установкой. Поскольку длина оптического пути в образцах короток, этот метод может быть применен к сильным поглощающих свет образцов, таких как углеродных нанотрубок 20 суспензий. Кроме того, в связи с его высоким пространственным разрешением, этот метод может быть применен к биологическим клеткам. Для его применения к биологии, этот метод также можно комбинировать с другими методами визуализации, такими как флуоресценция и обработки изображений комбинационного рассеяния. Таким образом, мы считаем, что динамическое рассеяние света микроскоп является мощным инструментом для широкого круга научных направлений.

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 &#181;m or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions4. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.
Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy5,6, low-coherence dynamic light scattering7,8, diffusing-wave spectroscopy9,10, and differential dynamic microscopy11,12.
We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope1. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-isopropylacrylamide, 98%</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>I0401</td><td></td></tr><tr><td>toluene, 99%</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>201-01876</td><td></td></tr><tr><td>petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 &amp;deg;C</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-22565</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetramethylethylenediamine, 99%</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate, 98%</td><td>Sigma</td><td>248614</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene latex suspension, 1 wt%</td><td>Duke Scientific Corporation</td><td>3500A</td><td></td></tr><tr><td>argon</td><td>Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.</td><td></td><td>purity &gt; 99.999 vol.%</td></tr><tr><td>cavity slide</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>83-0336</td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Nikon Instech Co., Ltd.</td><td>ECLIPSE Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate</td><td>Tokai Hit CO.,Ltd</td><td>TP-108R-C</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS 488LX</td><td></td></tr><tr><td>avalanche photodiode</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode</td><td></td></tr><tr><td>correlator</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-5000/EPP</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Время корреляционные функции интенсивности рассеянного света для полистирольных латексных суспензии (радиус частиц: 50 нм) были измерены при различных фокусных точках, как показано на рисунке 2 (а). Эти корреляционные функции были преобразованы в функции распределения гидродинамического радиуса по обратного преобразования Лапласа (см Рисунок 2 (б) и (с)). Используя ту же самую процедуру, временные корреляционные функции и функции распределения гидродинамического радиуса раствора PNIPA были получены при 25 ° С и 35 ° С соответственно. На рисунках 3 (а) и (б) показывают время корреляции функции интенсивности рассеянного света и соответствующие функции распределения частиц по размерам раствора PNIPA ниже (25 ° C) и выше (35 ° C) НКТР. Функции распределения частиц по размерам были получены с помощью обратного преобразования Лапласа, за которым следуюткоррекция частичного гетеродина. Средний гидродинамический радиус ниже НКТР составляет несколько десятков нанометров, что характерно для растворов полимеров. В отличие от этого, гидродинамический радиус выше НКТР составляет около 1,0 мкм. Этот результат согласуется с тем, что раствор мутный выше НКТР. Красные и синие линии на рисунке 3 представляют собой распределение по размерам PNIPA растворов , полученных сразу после и через 20 мин после раствора становился мутным, соответственно. На рисунке 3 (б) четко указывает на рост агрегации. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig1.jpg" /> Рисунок 1. Схематическое изображение динамического рассеяния света микроскопа. Точечным (РН), расщепитель луча (БС), поляризатор (Pol), и лавинные фотодиоды (ЛФД). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">нажмите сюда</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">чтобы просмотреть</a>увеличенная версия этой фигуры. <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig2.jpg" /> Рисунок 2. Представитель результаты для полистирола латекса суспензии. (А) Время корреляционные функции интенсивности рассеянного света для полистирольных латексных суспензии. Номинальный радиус составляет 50 нм, а концентрация составляет 0,1% мас. Два набора данных были получены из разных точек рассеяния. (Б), (в) соответствующие функции распределения размера для полистирольных латексных суспензии , полученные с помощью обратного преобразования Лапласа (а). Красная линия соответствует корреляционной функции времени, у которых начальная амплитуда составляет примерно 1,0, а синяя линия соответствует тому, что с начальной амплитудой, что составляет примерно 0,2. Горизонтальная ось была рассчитана без (б) и (с) с учетом эффекта частичного гетеродинирования (PHD), когда A &lt;&lt;<html> ; 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig3.jpg" /> Рисунок 3. Типичные результаты для решения PNIPA. (А) Время корреляционные функции интенсивности рассеянного света для решения PNIPA. (Б) соответствующие функции распределения размера для PNIPA раствора , полученного с помощью обратного преобразования Лапласа (а). Горизонтальная ось была рассчитана с учетом эффекта частичного гетеродини для каждого набора данных. Черная линия представляет собой данные, полученные при 25 ° С. Красная линия представляет собой данные, полученные после того, как только раствор становится мутным (35 ° C). Синяя линия представляет собой данные, полученные после измерения 20 мин красной линии./54885/54885fig3large.jpg &quot;Целевых =&quot; _blank &quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy at JoVE.com

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Протокол для прямого измерения распределения частиц по размерам в концентрированных растворах с использованием динамического рассеяния света микроскопии представлена.

Измерение Распределение частиц по размерам в мутных растворах с помощью динамического рассеяния света микроскопии

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

measurement-particle-size-distribution-turbid-solutions-dynamic-light

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Chemistry

Unit 1

The Laplace Transform

SCIENTISTS IN ACTION

14.3K Views.  University of Tokyo.  Протокол для прямого измерения распределения частиц по размерам в концентрированных растворах с использованием динамического рассеяния света микроскопии представлена. 

Video: Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Постоянное давление контролируемый методом экструзии для приготовления наноразмерных липидных везикул

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Bioengineering

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Дисперсия наноматериалов в средах: на пути к оптимизации протокола

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Environment

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this work, we use single particle tracking of fluorescently labeled PNIPAM microgels as a showcase for tuning microgel size by a rapid non-stirred precipitation polymerization procedure. This approach is well suited for prototyping new reaction compositions and conditions or for applications that do not require large amounts of product. Microgel synthesis, particle size and structure determination by dynamic and static light scattering are detailed in the protocol. It is shown that the addition of functional comonomers can have a large influence on the particle nucleation and structure. Single particle tracking by wide-field fluorescence microscopy allows for an investigation of the diffusion of labeled tracer microgels in a concentrated matrix of non-labeled microgels, a system not easily investigated by other methods such as dynamic light scattering.

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform PolyN-isopropylacrylamide Microgels

Non-stirred precipitation polymerization provides a rapid, reproducible prototyping approach to the synthesis of stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) microgels of narrow size distribution. In this protocol synthesis, light scattering characterization and single particle fluorescence tracking of these microgels in a wide-field microscopy setup are demonstrated.

Контролируемый синтез и флуоресценция отслеживание высокой однородности поли (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Микрогели

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

ДНК-магнитопорошковый обязательного анализа динамических и электрофоретической рассеяние света

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Применение напряжения в анализе динамического рассеяния света

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful platform for exploring the physics of polyelectrolyte interactions and also offer a promising solution to the pressing problem of delivering therapeutic oligonucleotides in vivo. Developing predictive structure-property relationships for PCMs has proven difficult, in part due to the presence of strong kinetic traps during nanoparticle self-assembly. This article discusses criteria for choosing polymers for PCM construction and provides protocols based on salt annealing that enable assembly of repeatable, low-polydispersity nanoparticles. We also discuss PCM characterization using light scattering, small-angle X-ray scattering, and electron microscopy.

We provide protocols and representative data for designing, assembling, and characterizing polyelectrolyte complex micelles, core-shell nanoparticles formed by polyelectrolytes and hydrophilic charged-uncharged block copolymers.

Сборка и характеристика полиэлектролитного комплекса Мицеллес

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood banks. Cells fragment off microparticles (MP) when they are stressed. Blood and blood components may contain cellular fragments from a variety of cells, most notably from activated platelets. When performing their roles as innate immune cells and major players in coagulation and hemostasis, platelets change shape and generate microparticles. With dynamic light scattering (DLS)-based microparticle detection, it is possible to differentiate activated (high microparticle) from non-activated (low microparticle) platelets in transfusions, and optimize the use of this scarce blood product. Previous research suggests that providing non-activated platelets for prophylactic use in hematology-oncology patients could reduce their risk of becoming refractory and improve patient care. The goal of this screening method is to routinely differentiate activated from non-activated platelets. The method described here outlines the steps to be performed for routine platelet inventory management in a hospital blood bank: obtaining a sample from a platelet transfusion, loading the sample into the capillary for DLS measurement, performing the DLS test to identify microparticles, and using the reported microparticle content to identify activated platelets.

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative in hospital blood banks. The goal is to differentiate activated from non-activated platelets to optimize the use of platelets. Providing non-activated platelets to hematology-oncology patients might reduce their high risk to become refractory.

Типовых скрининг метод для микрочастиц в трансфузии тромбоцитов

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Medicine

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal biopolymers may lead to a host of active and adaptable materials. However, engineering such materials with precisely tuned properties requires measuring how the dynamics depend on the network composition and synthesis methods. Quantifying such dynamics is challenged by variations across the time, space, and formulation space of composite networks. The protocol here describes how the Fourier analysis technique, differential dynamic microscopy (DDM), can quantify the dynamics of biopolymer networks and is particularly well suited for studies of cytoskeleton networks. DDM works on time sequences of images acquired using a range of microscopy modalities, including laser-scanning confocal, widefield fluorescence, and brightfield imaging. From such image sequences, one can extract characteristic decorrelation times of density fluctuations across a span of wave vectors. A user-friendly, open-source Python package to perform DDM analysis is also developed. With this package, one can measure the dynamics of labeled cytoskeleton components or of embedded tracer particles, as demonstrated here with data of intermediate filament (vimentin) networks and active actin-microtubule networks. Users with no prior programming or image processing experience will be able to perform DDM using this software package and associated documentation.

Differential dynamic microscopy (DDM) combines features of dynamic light scattering and microscopy. Here, the process of using DDM to characterize reconstituted cytoskeleton networks by quantifying the subdiffusive and caged dynamics of particles in vimentin networks and the ballistic motion of active myosin-driven actin-microtubule composites is presented.

Количественная оценка динамики цитоскелетов с помощью дифференциальной динамической микроскопии

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Инновационный метод для экзосома количественной и измерения размера

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Biology

Dynamic Light Scattering Analysis for the Determination of the Particle Size of Iron-Carbohydrate Complexes

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally heterogeneous nanoparticle complexes, which exhibit varying sensitivity to the conditions required for the methodologies available to physicochemically characterize these agents. Currently, the critical quality attributes of iron-carbohydrate complexes have not been fully established. Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a fundamental method to determine intact particle size and distribution. However, challenges still remain regarding the standardization of methodologies across laboratories, specific modifications required for individual iron-carbohydrate products, and how the size distribution can be best described. Importantly, the diluent and serial dilutions used must be standardized. The wide variance in approaches for sample preparation and data reporting limit the use of DLS for the comparison of iron-carbohydrate agents. Herein, we detail a robust and easily reproducible protocol to measure the size and size distribution of the iron-carbohydrate complex, iron sucrose, using the Z-average and polydispersity index.

Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a suitable assay for evaluating the particle size and distribution of intravenously administered iron-carbohydrate complexes. However, the protocols lack standardization and need to be modified for each iron-carbohydrate complex analyzed. The present protocol describes the application and special considerations for the analysis of iron sucrose.

Анализ динамического рассеяния света для определения размера частиц железо-углеводных комплексов

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally ...

Измерение Распределение частиц по размерам в мутных растворах с помощью динамического рассеяния света микроскопии

Резюме

Смотреть дополнительные видео

PLAYLIST