Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы наблюдать влияние гена SOX5 на сложность дендритных нейронов арборизации во время развития нейронов в Дрозофиле. Этот метод может помочь изучить морфогенез нейродендритов, а функцию гена в развитии нервной системы, лучше понять гены нейродегенеративных заболеваний. В конечном счете этот метод обеспечивает количественный анализ сложности дендритов, которые могут быть использованы в различных типах нейро-дендритов.
Последствия этого метода распространяются на генетический механизм нейродегенеративных заболеваний, потому что мутация является ключом к пониманию функции генов. Настройка крестов UAS-GFP;ppk-GAL4 с uaS-Sox102F-RNAi штамм мух или W118 управления. Культура мух при стандартных условиях при 25 градусах по Цельсию.
Примерно через пять-шесть дней, использовать типсы, чтобы тщательно собрать третий личинки instar для вскрытия. Поместите личинку в рассечение блюдо из кремния еластомер базы, и ткани культуры Петри блюдо. Затем поместите блюдо под микроскопом вскрытия.
Теперь прикрепите хвост личинки, чтобы разоблачить средней линии. Затем контактный личинки рот крючки так спинной стороны личинки вверх. Теперь добавьте 200 микролитров PBS в блюдо, чтобы погрузить личинку в раствор.
Затем вырежьте хвост и рот личинки небольшими разрезами. Затем вырежьте личинку открытой вдоль спинной средней линии и между двумя трахеями, переходя от каудала к ростралу. Затем поместите булавку на каждый из четырех углов тела, чтобы тело лежит плоским.
Теперь исправить стенки тела личинки в четыре процента PFA в течение 25 минут при комнатной температуре. Затем мыть личинку с PBS три раза в течение пяти минут за стирку. После мытья снимите булавки и перенесите ткань на стеклянную горку.
Затем погрузите ткань в антифад монтажа среды, и смонтировать его с крышкой скольжения. Разрешить установленной ткани в воздух сухой в течение часа, прежде чем уплотнения на крышке скольжения с ногтем польский. Храните эти слайды в темноте при четырех градусах по Цельсию.
Захват z-серии изображений с конфокального микроскопа с помощью 20X цели. Во-первых, установить диапазон z-шаги, чтобы включить все нейроны DA в стене тела личинки, и установить размер шага до половины микрометра. Затем храните изображения в качестве файлов TIF или ND2 для обработки.
Затем оцените количество и морфологию дендритов на нейронах DA. Начните с оценки их длины. Во-первых, на Фиджи ImageJ, разделить изображения на отдельные каналы, если это необходимо.
Только канал GFP должен быть оценен. Далее сделайте z-проекцию. В новом окне выберите максимальную интенсивность для типа проекции и выберите стартовые и стоп-срезы.
Затем нажмите OK, чтобы создать изображение z-проекции с четкими дендритными проекциями. Теперь отследить невриты с помощью плагина инструмент. Во-первых, перейдите к соме нейрона интереса и нажмите, где один дендрит выходит из клеточного тела.
Затем нажмите на кончик этого дендрита. Если синяя линия, соединяющая две точки, проходит по длине нейрита, нажмите Y для да. Затем, если эта строка соответствует полному пути нейрита, нажмите полный путь.
Если линия не соответствует пути, то нажмите на точки дальше по этому нейриту, чтобы согнуть путь в несколько сегментов линии, которые будут соответствовать длине нейрита. Затем щелкните полный путь и приступайте к маркировке пути для следующего нейрита. После завершения всех путей отслеживания выберите опцию «Анализ, измерения путей» для экспорта путей в файл CSV.
Используйте эти данные для расчета и среднего значения длины пути для анализа. Затем рассчитайте площадь поверхности нейрона. Во-первых, выберите инструмент рисования свободной руки из окна Fiji ImageJ.
Затем соедините конечные точки нейрона интереса. Затем выберите опцию «Мера» из окна анализа. Результат отображается в новом поле со значением выбранной области.
Копировать это значение в программное обеспечение для анализа данных. Наконец, вычислите общее количество ветвей с помощью плагина Analyze Skeletonized Paths. Дендриты нейронов DA были помечены совместно overexpressing GFP в их сома и дендритов беседки для анализа GFP флоресцев изображений.
Морфология дендритов была изображена с помощью перевернутого конфокального микроскопа. Дендриты нейронов DA были прослежены, как описано. Файл использовался для оценки длины дендрита.
Замалчивание Sox102F в нейронах DA в третьем личинке instar привело к значительному сокращению общего числа дендритов примерно с половиной длины ветви и с более простой структурой, показывая только половину количества ветвей. Логично, что это привело к сокращению площади поверхности беседки. Этот протокол обеспечивает быстрый метод для оценки развития DA сенсорных нейронов.
При попытке этой процедуры, не забудьте взять достаточное количество изображений каждой группы нейронов DA, чтобы получить хорошее покрытие. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как дендритный анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы о разработке дендрита. С момента своего развития, этот метод помог исследователям в области неврологии сделать выводы в нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера с помощью модельных систем.
