Этот метод является важным инструментом в области модификации белка, что позволяет легкое и эффективное поколение антител наркотиков конъюгации. Основными преимуществами этой техники являются простота обработки, высокая урожайность выработки антител, скорость психодизионной реакции и стабильность формирования связи. Начните эту процедуру с выращивания клеток подвески HEK, как описано в текстовом протоколе.
Когда плотность 2,5 миллиона клеток на миллилитр будет достигнута, подготовить свежий раствор циклопропена производные лизина, или CpK, в 1 моляр натрия гидроксида. Добавьте 2,5 миллилитров CpK к экспрессии среды, дополненной антибиотиками. Хорошо смешайте раствор и добавьте 250 микролитров одного молярного HCl, а затем стерилизовать раствор с помощью фильтра 22 микрон.
Теперь центрифуга 125 миллионов клеток при целевой плотности в течение пяти минут при 500 х г. После центрифугации добавьте смесь реагентов ДНК-трансфекции в среду экспрессии, содержащую CpK, и используйте эту среду для повторного перерасхода клеток. Через шесть-семь дней после добавления CpK, урожай trastuzumab подшипник cpK антитела от супернатанта путем центрифугирования клеток в течение 15 минут на 3000 х г.
Затем отфильтруй супернатант. Теперь добавьте 5x буфер мытья шарика в 250 миллилитровых конических трубках и смешайте с супернатантом и добавьте preequilibrated протеин смола. Поместите коническую трубку на ролик в течение трех часов при комнатной температуре, чтобы вытащить антитела и супернатанта.
После инкубации перенесите белок смолы со супернатантом в колонку и дайте жидкости протекать. Затем добавьте 25 миллилитров буфера стирки и дайте этому пройти. Добавьте один миллилитр одного молярного фосфатного буфера, 150 миллимолярный хлорид натрия в трубку сбора и утешите антитела четырьмя миллилитров 1 молярного цитратного рН 3.
Кислый раствор немедленно нейтрализуется, так как он исходит от колонки основным раствором, уже присутствующим в трубке сбора. Далее разбавляют антитела 10 миллилитров PBS. Сосредоточьте антитела до 5 к одному миллилитров центробежной фильтрации и обмен буфера три раза с PBS.
Очистив образцы FPLC с помощью бутил гидрофобного взаимодействия колонки с нулевым до 100% градиент низкой соли буфера в буфер высокой соли в течение 30 минут. Соберите все фракции и следите за элюционом на 280 нанометров. Сосредоточьте фракции, содержащие антитела, центробежной фильтрацией и трижды обменяв их на PBS.
Антитела могут храниться при четырех градусах цельсия. Монометилавратин E, или MMAE, является высокотоксичным. Поэтому используйте перчатки и очки при обращении с производными MMAE.
Если вы используете неизмененные MMAE в качестве контроля, обрабатывать твердый продукт внутри дыма капот при подготовке фондового решения в MSO. Чтобы спрягать антитела с молекулой подшипника тетразина, разбавить 10 молярной эквивалентности тетразина MMAE на антитела с 20 микролитров ацетонитрила и 76 микролитров PBS в небольшой конической трубке. Добавьте один молярный эквивалент трастузумаба подшипника CPK.
Смешайте тщательно и позволяют реагировать в течение трех часов при комнатной температуре, чтобы сформировать trastuzumab связано с MMAE. Молекулы, кроме MMAE потенциально больше и более стерически препятствует могут быть связаны с антителами с помощью этого протокола. Добавьте весь объем реакции на спиновую колонку и центрифугу при 1500 x g в течение одной минуты.
Чтобы проанализировать спряжение, уравночные HPLC HIC колонки со 100%-м высоким буфером соли в течение пяти минут. Затем смешайте 15 микролитров по миллиграмму на миллилитр раствора трастузумаба, связанного с MMAE, с 15 микролитров 2X высокосоленого буфера во флаконе. Введите смесь на столбец HPLC.
Elute в изократическом один миллилитр в минуту потока со 100%-ным буфером соли в течение одной минуты. Следуйте этому с 15-минутным градиентом от 100 до нуля процентов высокого буфера соли в буфере с низким содержанием соли. Мониторинг elution на 280 нанометров.
Интегрируйте пики на хроматограмме со временем удержания 7,5, 9,2 и 11,5 минут, которые соответствуют трастузумабу с нулем, одним и двумя конъюгированными токсинами соответственно. Теперь вычислите DAR, добавив области пиков на 9,2 минуты, которая имеет вес один, и 10,5 минут, который имеет вес два, и разделить на общую площадь трех пиков. Для анализа конъюгации LC-MS, во-первых, дегликосилат 30 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр ADC и неизмененные антитела в условиях, не снижающихся с использованием 250 единиц PNGase F, по крайней мере шесть часов при 37 градусов по Цельсию.
Оттепель сыворотки и фильтровать его через 22 микрон фильтра. Затем заполните внешние колодцы 96 хорошо пластины с водой. В центральных скважинах смешайте в трилистических 90 микролитров сыворотки с 10 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр трастузумаба тетраметхилдодамин в PBS при конечной концентрации 1 миллиграмм на миллилитр.
Поместите пластину в инкубатор, насыщенный влажностью при 37 градусах Цельсия и четырех процентах CO2. Каждые 24 часа в течение пяти дней, пипетка каждый хорошо перемешать и принять пять микролитер aliquot. Вспышка заморозить aliquot с жидким азотом и хранить при 80 градусов по Цельсию.
После того, как все образцы были собраны, оттепель aliquots и анализировать с помощью косвенных ELISA, как подробно описано в текстовом протоколе. Кроме того, коммерческий комплект ELISA может быть использован для измерения концентрации ADC. За два дня до анализа заполните водой внешние колодцы 96 колодцев.
Затем поднимите клетки с 05%трипсином в 5 миллимолях EDTA. Центрифуга клетки три минуты при 250 х г и повторного перерасхода в новой среде. Затем семя 3000 клеток в 100 микролитров на колодец в 96 пластин и поместить их обратно в инкубатор.
Через два дня после посева клеток, подготовить серийные разбавления всех образцов в три части с 1%DMSO в полной среде. Теперь добавьте 100 микролитров каждого образца в каждую колодец и инкубировать в течение пяти дней при 37 градусах Цельсия и четыре процента CO2. На пятый день измерьте жизнеспособность клетки.
С этой целью используйте коммерческий комплект для облиза клеток и измерения выпущенного АТФ. Участок процент сигнала в отношении контрольных клеток, обработанных с 1%DMSO. АЦП могут быть инкубированы при 37 градусах по Цельсию в течение пяти дней в сыворотке крови и анализ на цитотоксию, чтобы доказать функциональную стабильность.
Антитело с ручкой циклопропена можно получить с помощью этой процедуры с урожайностью выше 20 миллиграммов на литр после очищения белка А. Вырабатываемое антитело может быть быстро и специально конъюгировано к токсину с тетразином. При спряжении антитела с токсином, среднее отношение препарата к антителам превышает 1,9, как измеряется гидрофобной хроматографии взаимодействия.
Личность ADC подтверждается масс-спектрометрией. Дигидропиридизеновая связь стабильна в сыворотке крови человека в течение пяти дней при 37 градусах Цельсия. Конъюгированный препарат антител является мощным и выборочно убивает клетки с высоким уровнем HER2, а не клетки с низким уровнем HER2.
Кроме того, антитела без токсина и токсина, модифицированного с тетразином linker имеют очень низкую токсичность. Токсин сам по себе показывает, не-HER2 зависимой токсичности подчеркнув необходимость ориентации для достижения избирательности. После этой процедуры мы можем быстро и эффективно подготовить конъюгации антител для лечения опухолей.
Потенциально, любой препарат, функционализированный с тетразином, может быть связан с любым антителом, нацеленным на биомаркер раковых клеток. Последствия этого метода распространяются на любой протеиновый конъюгированный, предназначенный для терапии или диагностики.
