Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области заболеваний почек. Особенно в понимании гломерула в нормальных и больных состояниях. Гломерулярная биология может быть трудно изучать из-за разнообразия типов клеток настоящее время и их уникальной структуры.
Основным преимуществом этой техники является предоставление легкодоступного источника нетронутыми glomeruli с использованием простых методов и оборудования. Этот метод имеет последствия для нашего понимания фильтрационного барьера в нормальной и больной почки. В частности, это может пролить свет на наше понимание белкового хронического заболевания почек, при котором гломерулярная травма приводит к аномально высокой секреции белков сыворотки в мочу.
Как правило, лица, новые для этого метода будут иметь трудности с получением адекватной урожайности и чистоты в окончательном образце. Демонстрацией процедуры будет Бриттни Раш, техник из моей лаборатории. Для начала используйте ножницы для удаления волос с переднего живота усыпной крысы.
Используйте 70% этанола для очистки открытой кожи. Затем, используя хирургические ножницы, сделать разрез средней линии в коже. Чтобы разоблачить внутренние органы, сделать разрез средней линии через мышечный слой.
Найдите и изолируйте почки и поместите в стерильную 50-миллилитровую пластиковую коническую трубку с 30 миллилитров буферного соленого раствора Хэнка или HBSS, помещенных на лед. Перенесите трубку на льду в стерильный капюшон культуры клеток. Перенесите почки в стерильную чашку Петри, содержащую пять миллилитров HBSS, помещенных на лед.
Используйте ножницы и острые миппы, чтобы удалить и отказаться от периренального жира. Чтобы удалить и отбросить капсулы, окружающие почку, сделайте небольшой поверхностный разрез, а затем используйте острые миппы, чтобы аккуратно вытащить его из почки. Поместите почки на стерильную марлю во второй чашке Петри с пятью миллилитров HBSS и разделить каждую почку пополам через середину сагиттарной секции.
Используйте скальпель, чтобы удалить и отбросить медуллу, которая может быть идентифицирована по его темному цвету и центральному расположению. Перенесите оставшиеся части, содержащие преимущественно кору почек, в третью чашку Петри с пятью миллилитров HBSS. Используйте стерильные лезвия бритвы, чтобы фарш их до тех пор, пока куски меньше одного миллиметра в размерах или до тех пор, пока паста формируется.
Используйте 1%BSA PBS, чтобы промокнуть верхнюю и нижнюю часть сито 180 микрометров на стакане 500 миллилитров. Этот шаг имеет решающее значение, поскольку он покрывает сито с белком и снижает соблюдение гломерули, которые затем улучшить урожайность. Поместите смешанную кору на небольшой край сито.
Используйте текстурированный фланг поршеня из 10 миллилитров одноразового шприца, чтобы замять ткань через сито в нижнюю кастрюлю, помещенную на лед. Промыть периодически с HBSS, используя как можно меньше, чтобы избежать разбавления образца и повторного использования жидкости сбора в нижней кастрюле для полоскания сито. После завершения sieving, тщательно мыть дно сито с HBSS из нижней части кастрюли, чтобы захватить любые слабо придерживались glomeruli.
Разделите всю жидкость из нижней кастрюли на 10 миллилитровых шприцев, оснащенных 20 калибровочных игл. Перейдите жидкость через иглу по крайней мере три раза в нижней кастрюле. Для последней коллекции держите гломерули, содержащие жидкость в шприце, пока не будет готов пройти через сито 90 микрометров.
Между тем, мыть нижнюю кастрюлю, промыв его с 1%BSA PBS и в стакан отходов. Используйте 1%BSA PBS, чтобы промокнуть верхнюю и нижнюю часть сито 90 микрометров, а затем поместить его в верхней части нижней кастрюли. Нанесите образец в шприцах на один край сито.
Используйте текстурированный поршень фланг, чтобы каша ткани через сито, как это было сделано ранее. Используйте раствор из нижней кастрюли, чтобы вымыть ткань и собрать все от одного края сито. После того, как sieving завершена, тщательно мыть дно сито с буфером HBSS из нижней части кастрюли, чтобы захватить любой glomeruli, которые могут быть свободно придерживались.
Соберите всю жидкость из нижней кастрюли в 50 миллилитров пластиковой конической трубки. Используйте 1%BSA PBS для мытья нижней кастрюли в стакан отходов. Затем используйте 1%BSA PBS, чтобы промокнуть верхнюю и нижнюю часть сито 75 микрометров.
Поместите сито поверх нижней кастрюли, помещенной на лед. Нанесите образец на один край сито с жидкостью, протекающей через легко. Промыть верхнюю часть сито с минимум 20 миллилитров 1%BSA PBS в стакан отходов и тщательно промыть дно сито.
Чтобы собрать гломерули, которые остались на вершине сито 75 микрометров, промыть через сито вверх дном с таким же HBSS, как необходимо для сбора glomeruli в чашке Петри. Соберите просеянные гломерули в 50-миллилитровую пластиковую коническую трубку на льду. После центрифугирования в 1800 раз G в течение пяти минут при четырех градусах цельсия, удалите супернатант тщательно с помощью пипетки.
Повторно приостанавливайте гранулы в 10 миллилитров холодного HBSS. Объедините образцы и повторите центрифугу. Повторно приостанавливать гломерули в пяти миллилитров HBSS.
Чтобы подсчитать общий гломерули, поместите 10 микролитровую каплю образца на стеклянную горку, посчитайте под микроскопом и несколько на 500, чтобы получить общий урожай. Изолированные структуры должны состоять почти из всех гломерули без трубчатых структур. Если трубоубийки присутствуют и повлияют на ваше применение вниз по течению, они могут быть удалены, применяя весь образец к сито 90 микрометров и повторяя протокол с этого момента.
Описанный здесь протокол эффективен в изоляции гломерули, а окончательная подвеска плотно упакована с гломерули с чистотой более 95% и минимальным загрязнением от трубчатых сегментов или других типов клеток. Эти гломерули могут быть окрашены гематоксилин и эозин пятна для просмотра их морфологии. Кроме того, они сохраняют свою структуру на протяжении всего протокола даже после обработки.
Они сохраняют нетронутые и жизнеспособные подоциты, мезангиальные клетки и эндотелиальные клетки. Изолированные гломерули подверглись воздействию химических травм для имитации патологии in vivo. В частности, протамин сульфат, который нарушает заряд glomerular фильтрации барьера.
В отличие от здорового гломерули, протамин сульфат лечение гломерули, имеют заметное снижение нефрона и ряд ядер положительный для WT1. При просмотре с передачей электронной микроскопии, здоровые гломерули показывают типичные процессы ног. После протамина сульфат лечения, ноги процессы удлиненные или стерты с указанием травмы подоцитов.
Для определения жизнеспособности клеток в изолированных гломерули, расщепленная каспаза три наблюдалась в качестве маркера апоптоза. Существовал не расщепленные каспазы три на нуле и через час после изоляции glomeruli. Несколько клеток показали признаки апоптоза в два и четыре часа с прогрессивным увеличением с течением времени.
Наибольшее количество апоптотических клеток было отмечено в 24 и 48 часов. Основываясь на этих результатах, мы рекомендуем использовать изолированные гломерули сразу после изоляции для большинства экспериментов. При выполнении этой процедуры важно работать быстро и эффективно.
С того момента, как почка изолирована, гломерули начинают ухудшаться. Чем быстрее вы изолируете glomeruli, тем больше времени вам придется представлять, изоляции, манипуляции. После изоляции изолированные гломерули могут подвергаться воздействию химических или биологических агентов для стимуляции физиологических или патологических состояний.
А образцы могут быть процессом изоляции белка или РНК, гистологии или иммунофлуоресценции и электронной микроскопии. С момента своего развития в 1950-х годах, этот метод помогал исследователям в изучении гломерулярной биологии. В целом, этот протокол предоставляет метод для оценки морфологических и клеточных характеристик нетронутых гломерули в нормальных и больных состояниях.
Этот метод может помочь нашему пониманию белково-хронической болезни почек и помочь в развитии будущих методов лечения.
