Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нефрологии о роли торговли белками поверхности клеток в белковой, а не белковой болезни почек. Основными преимуществами этого метода являются то, что он облегчает изучение торговли белками поверхности клеток in-vivo и что более одного белка может быть проанализировано за эксперимент. Хотя этот метод может дать представление о торговле поверхностью гломерулярных клеток, он также может быть применен к другим системам органов, которые пронизаны и доступны с помощью методов изоляции.
Начните с подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша и дезинфекции брюшной стороны обезболивающей мыши с 70%isopropyl. Сделайте медианный разрез через кожу от таза до грудины и используйте пинцет, чтобы удалить кожу из брюшной фасции. Вырезать кожу по обе стороны от брюшной средней линии и сделать средний через брюшной мышечный слой от мочевого пузыря до xiphoid.
Используйте ножницы и щипцы, чтобы разделить мышцы на четыре квадранта и использовать два хирургических зажима для обеспечения верхних двух квадрантов к шее животных. Поместите животное под рассекающий микроскоп и используйте стерильный своп, чтобы отойти в сторону висцеральных органов. Используя тонкие ножницы, вырезать печеночными френическими связками.
Используя тонкие хирургические пинцеты, поместите один шов вокруг печеночной мезентерической артерии branial почечных артерий. И вокруг аорты, проксимальной для почечных артерий, у надпочечников. Освободите дистальную аорту от фасции, жира и других тканей.
Затем зажим вены и аорты на высоте бифуркации и поместите еще один шов вокруг аорты дистал почечных артерий. Используйте пинцет, чтобы затянуть проксимальный шов аорты, окутая кровоток и вырезать небольшое отверстие половину диаметра аорты в аорту, дистал почечных артерий. Вставьте 10-сантиметровый катетер, прикрепленный к 10 миллилитровому шприцу, содержащем пять миллилитров ледяного PBS плюс кальций и магний в аорту.
И починить катетер с помощью подготовленных лигатур. Затем начните perfusing почек на два миллилитра в минуту скорости потока. Использование тонких ножниц, чтобы вырезать отверстие в почечной вены на почечных артерий и ужесточение шва вокруг печеночными и мезентерическими артериями.
После того, как весь объем PBS был доставлен заменить перфузировать с пятью миллилитров ледяной PBS плюс кальций и магний дополняется 0,5 миллиграммов на миллилитр биотина для маркировки поверхности. Продолжайте окутыкать почки на два миллилитра в минуту скорость потока. Когда весь объем был доставлен, приложите шприц, содержащий пять миллилитров ледяного PBS плюс кальций и магний, дополненный 100 миллимолярный глицин к катетеру.
Утолить гломерули со всеми пятью миллилитров раствора глицина на два миллилитра в минуту скорости потока. Затем пронизыть почки с пятью миллилитров ледяной PBS плюс кальций и магний дополняется 200 микролитров магнитных бусин на миллилитр на два миллилитра в минуту скорости потока. Эмболизация гломерули с помощью коричневых магнитных бусинок будет видна на поверхности почек.
Когда все бусы были доставлены удалить капсулу почек и урожай почек на hilum. Поместите почки в 10-сантиметровую клеточную культуру, содержащую 15 миллилитров PBS плюс кальций и магний. Используйте новый двойной край лезвие, чтобы сократить почки на самые маленькие кусочки возможно.
Перенесите ткань в двухми миллилитровую трубку, содержащую один миллилитр коллагеназы А в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, мягко смешивая раствор ткани до и после пищеварения с модифицированным наконечником пипетки 1000 микролитров. В конце инкубации фильтруемую ткань через 100 микрон-клеточный ситечко. Используйте клеточный скребок и ледяной PBS плюс кальций и магний, чтобы пюре оставшейся ткани через ситечко клетки.
Довнесите конечный объем одноклеточной суспензии почек до 50 миллилитров со свежим ледяным PBS плюс кальций и магний и соберите клетки почек путем центрифугации. Удалите супернатант затем повторно приостановить гранулы с чуть менее 1,5 миллилитров ледяной PBS плюс кальций и магний во время вихря и передачи гломерулярной подвески в новую двухми миллилитровую трубку. Чтобы вымыть гломерули, поместите трубку в магнит, чтобы агрегировать гломерули.
Через минуту используйте 1000 микролитровую пипетку, чтобы удалить супернатант. И снимите трубку с магнита. Добавьте один миллилитр PBS плюс кальций и магний в ткани.
Pipette glomeruli вверх и вниз один раз и вихрь клеток. Вернуть трубку к магниту и мыть glomeruli снова, как только что продемонстрировали. До тех пор, пока чистота образца не достигла по крайней мере 90% путем анализа светового микроскопа при увеличении от 40 до 100 X.
Затем соберите магнитный шарик очищенный glomeruli центрифугации. Для достижения более чем 95% чистоты, glomeruli необходимо тщательно мыть, как попродемонстрировано. Биотин перфузия облегчает маркировку капиллярных петель в биотине, но не контролируется перфузных почек мыши.
Иммунные осадки биотиновой фракции гломерулярных экстрактов показывают, что гломерулярные трансмембранные белки нефрин и подокаликсин иммунопреципиентированы биотином, но не контрольной фракцией. Окрашивание иммунопреципитанной фракции стрептавидином еще раз подтверждает наличие биотина в биотине нефрина в биотине, обливленном, но не контролю перфекционированных животных. Эндотелиальный белок сосудистого эндотелиального кадерин и внутриклеточная молекула адгезии два также иммунопреципиентированы в биотиновой фракции.
В ранней фазе нефротоксического нефрита снижение экспрессии нефрина поверхности клетки наблюдается у нефротоксических нефритовых животных по сравнению с контролем. Действительно денситометический анализ показывает значительное снижение биотина laded нефрита в нефротоксических животных нефрита по сравнению с контроллерами. Количественный анализ общего соотношения нефрита к актину не выявил существенных различий между контролем и нефротоксическим нефритом мышей.
Кроме того, одинаковое количество подоцитов наблюдается при нефротоксических нефритах и контрольных животных. В позднем нефротоксическом нефрите, нефротоксические нефритические животные демонстрируют восстановление экспрессии нефрита без существенных различий в нефрине поверхности клеток, измеренных между контролем и нефротоксическими нефритическими мышами, и общее общее сокращение нефротических нефритовых животных. Кроме того, количество подоцитов снижается по сравнению с контрольных животных.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы сохранить пузырьк шприцев бесплатно во время их соединения, чтобы избежать эмболии воздуха гломерули и работать в условиях ледяного холода, как только перфузия почек началась. После этой процедуры другие методы, такие как изоляция РНК гломерули и белка могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о экспрессии белка или взаимодействия в здоровых и больных почек.
