Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о клеточном цикле и динамике популяции зародышевой линии стволовых клеток в C.elegans. Основные преимущества этой техники в том, что она не требует трансгенов, она совместима с иммунофлуоресцентным окрашиванием, и она может быть изменена для изучения клеток при самых разных условиях. Я был очень взволнован, когда я впервые увидел этот метод используется в лаборатории Scheda.
Хотя этот метод может дать представление о клеточном цикле C.elegans, он также может быть применен к более широким вопросам о старении, питании или измененных генотипах. Вообще лаборатории новые к этому методу могут бороться с первоначально idiodisprepation или C.elegans гематоксилин окрашивание. Начните с использования стерильной техники, чтобы добавить 200 микролитров 10 миллимолейных EdU в 100 миллилитров буфера M9 и соответствующие добавки к четырем миллилитрам свежеростой ночной культуры MG 1693 E.coli.
Создание идиотизм требует деликатного баланса между Эду и тимидин добавок. Как количество тимидин должно быть достаточно для кишечной палочки расти хорошо, в то время как количество EdU должно быть достаточно для надежного щита от выравнивания. После не более чем 24 часов при 37 градусах по Цельсию и 200 об/мин, используйте стерильную технику, чтобы разделить культуру между двумя-четырьмя стерильными 50 миллилитровыми коническими трубками для центрифугации.
Resuspend пеллатин четыре миллилитров свежего буфера M9 и использовать тот же пипетку, чтобы применить около 8 капель EdU помечены E Coli MG1693 решение в центре индивидуальной комнатной температуры 60 миллилитров M9 охранник Петри блюда. Чтобы накормить бактерии EdU помечены нематод, использовать свежие PBS мыть C.Elegans из нематод роста среднего блюда в 1,5 миллилитровую трубку и позволяют животным поселиться кратко тяжести. Вымойте животных один-два раза с одним миллилитров PBS и использовать стеклянный пастер пипетку для передачи нематод на центр лужайки EdU в крошечной капле PBS.
Подождите несколько минут, пока жидкость будет поглощена и инкубировать культуру, по крайней мере 30 минут при 20 градусах по Цельсию в соответствии с экспериментальным протоколом. В конце инкубации используйте два миллилитров PBS, чтобы смыть червей из пластины культуры EdU в стеклянное рассекаемое блюдо. После вскрытия и фиксации нематод гонады, как описано ранее, промыть небольшой один миллилитр borosilicate стеклянная трубка и длинный стеклянный пастер пипетку с PBS дополнены 0,1%tween 20 и использовать пипетку для передачи фиксированных гонад в трубку в небольшом количестве PBS tween.
Соберите гонады центрифугации и использовать длинный, вытянутый стеклянный пипетка пастбища, чтобы удалить как можно больше супернатентов, как это возможно, не нарушая гранулы гонады. Для обнаружения EdU добавьте 100 микролитров коктейля EdU в гонады и накройте трубку лабораторной пленкой для инкубации от 30 до 60 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть гонаду один раз с 100 microLiters реакции промыть буфер, и четыре раза с одним миллилитром PBS tween.
После последней стирки добавьте в образец 25 микролитров антиутухающей монтажной среды, дополненной DAPI. В то время как среда оседают над гонадами, поместите большую 2,5%agarose площадку на стандартный стеклянный микроскоп слайд. Затем сгладить со вторым слайдом.
Затем используйте длинный стеклянный пастер пипетку и храните всю жидкость и гонады в узком кончике пипетки, чтобы свести к минимуму потерю образца при передаче гонад на площадку. Используя ресницы, приклеенные к зубочистке, распределите гонады по агарозной площадке и удалите частицы пыли. Затем медленно опустите прямоугольную стеклянную крышку скольжения на гонады, заботясь, чтобы избежать пузырьков воздуха, и удаление любого избыточного раствора с лабораторной ткани.
Подсчет ячеек в трех измерениях надежно требует некоторой практики. Использование плагина счетчика ячеек Фиджи и скрипта, как метки ячеек, чтобы удалить любые дубликаты помогает сделать счета воспроизводиться. После того, как крышка скольжения урегулировать на ночь, использовать ячейку счетчик плагина и Фиджи вручную рассчитывать каждое ядро, маркировка каждого отдельного ядра в зависимости от наличия или отсутствия фосфохистон три EdU или прегенетор зоны маркировки клеток.
Сигнал EdU ко локализуется с сигналом DAPI. В некоторых ядрах сигнал EdU охватывает все хромосомы, в то время как в других ядрах сигнал EdU локализуется до одного-двух ярких панкт, вероятно, на Х-хромосоме, которая размножается в конце S-фазы. Сигнал EdU от успешной 30-минутной маркировки локализуется примерно до половины ядер в предродовой зоне.
В то время как техника работает последовательно в диком типе молодых взрослых животных, значительная часть спариваых 5-дневных гермафродитов не может обозначить в 30-минутный пульс ЭдУ. Продолжительность G2 можно оценить, проанализировав процент ядер в M-фазе, которые являются EdU положительными в течение всего периода времени, что позволяет вычислить медиану и максимальную продолжительность G2. Продолжительность G2 и G1 можно оценить по проценту всех ядер предгенеторной зоны, которые являются положительными, что позволяет вычислить максимальную продолжительность комбинированных фаз. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы использовать ту же партию блюд EdU, чтобы свести к минимуму межиммиакументабельную изменчивость.
После этой процедуры, другие методы, такие как окрашивание дополнительными антителами могут быть выполнены или ответить на дополнительные вопросы о клеточном цикле, клеточной судьбы, или сигнализации путей. Не забывайте, что работа с нуклеицидными аналогами и парафермельдагидом может быть опасной, и что меры предосторожности, такие как ношение азотных перчаток, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.
