يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دورة الخلية وديناميات مجموعات الخلايا الجذعية الخط الجرثومي في C.elegans. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب transgenes ، فهي متوافقة مع التلطيخ المناعي ، ويمكن تعديلها لدراسة الخلايا في ظل ظروف مختلفة كثيرة. كنت متحمسا جدا عندما رأيت لأول مرة هذه الطريقة المستخدمة في مختبر Scheda.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في دورة الخلية C.elegans، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أسئلة أوسع حول الشيخوخة، والتغذية، أو تغيير الأنماط الجينية. عموما مختبرات جديدة لهذه الطريقة قد النضال مع التعابير الأولية أو C.elegans تلطيخ الدم. تبدأ باستخدام تقنية معقم لإضافة 200 ميكرولتر من 10 ملليمولار EdU في 100 ملليلتر من M9 العازلة والمكملات المناسبة لأربعة ملليلتر من المزروعة حديثا بين عشية وضحاها MG 1693 E.coli الثقافة.
جعل الوديه يتطلب توازن دقيق بين EdU والتكملة ثيميدين. كما يجب أن تكون كمية من thymidine كافية لE القولونية لتنمو بشكل جيد، في حين أن كمية EdU يجب أن تكون كافية لدرع قوية ضد التسوية. بعد ما لا يزيد عن 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة، واستخدام تقنية معقمة لتقسيم الثقافة بين اثنين إلى أربعة أنابيب مخروطية 50 ملليلتر معقم للطرد المركزي.
Resuspend بيلاتين أربعة ملليلتر من M9 العازلة الطازجة واستخدام نفس الماصة لتطبيق حوالي 8 قطرات من EdU المسمى E كولي MG1693 حل إلى مركز درجة حرارة الغرفة الفردية 60 ملليلتر M9 A حارس بتري الأطباق. لتغذية EdU البكتيريا المسماة إلى الديدان الخيطية، واستخدام برنامج تلفزيوني جديد لغسل C.Elegans من طبق متوسط نمو الخيطيات في أنبوب 1.5 ملليلتر والسماح للحيوانات لتسوية لفترة وجيزة عن طريق الجاذبية. غسل الحيوانات مرة واحدة إلى مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني واستخدام ماصة البسترة الزجاج لنقل الديدان الخيطية إلى وسط حديقة EdU في قطرة صغيرة من برنامج تلفزيوني.
انتظر بضع دقائق حتى يتم امتصاص السائل واحتضان الثقافة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 20 درجة مئوية وفقًا للبروتوكول التجريبي. في نهاية الحضانة، استخدم ميليتين من برنامج تلفزيوني لطرد الديدان من لوحة ثقافة EdU في طبق تشريح الزجاج. بعد تشريح و تثبيت الشناء الخيطية كما سبق وصفها، شطف أنبوب زجاجي بوروسيليكات ملليلتر صغير وماصة طويلة من الزجاج البسترة مع PBS تكملها 0.1٪ توين 20 واستخدام ماصة لنقل السنادات الثابتة إلى الأنبوب في كمية صغيرة من توين برنامج تلفزيوني.
جمع الغنود عن طريق الطرد المركزي واستخدام طويلة، رسمها من المرعى الزجاج ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من الخارقة دون إزعاج بيليه الغنود. للكشف EdU، إضافة 100 microLiters من فوق كوكتيل EdU إلى ال غونادس وتغطية أنبوب مع فيلم المختبر لاحتضان 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل الغدد الغدد الغدد الصوابع مرة واحدة مع 100 microLiters من رد فعل شطف العازلة، وأربع مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني توين.
بعد الغسيل الأخير، إضافة 25 microLiters من مضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة تستكمل مع DAPI إلى العينة. في حين أن المتوسطة تستقر على الرناد، ضع لوحة كبيرة 2.5٪agarose على شريحة مجهر زجاجي قياسية. ثم تسطيح مع شريحة ثانية.
بعد ذلك، استخدم ماصة طويلة من الزجاج البسترة والحفاظ على كل من السائل والسناد في الطرف الضيق من الماصات لتقليل فقدان العينة عند نقل ال غونا إلى لوحة. باستخدام رمش ملتصق بواكة المسواك، قم بتوزيع السنادس على وسادة أغاروز وإزالة أي جزيئات الغبار. ثم خفض ببطء غطاء زجاجي مستطيل زلة على الشنطة، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء، وإزالة أي حل الزائدة مع نسيج المختبر.
عد الخلايا في ثلاثة أبعاد يأخذ بعض الممارسة بشكل موثوق. استخدام فيجي خلية العداد في المكونات وسيناريو مثل علامات الخلايا لإزالة أي مكررة يساعد على جعل التهم استنساخها. بعد السماح للغطاء زلة لتسوية بين عشية وضحاها، واستخدام الخلية عداد المكونات في وفيجي لحساب يدويا كل نواة، ووضع العلامات على كل نواة الفردية وفقا لوجود أو غياب phosphohistone ثلاثة EdU أو pregenetor تسمية خلية المنطقة.
إشارة EdU تشارك في الترجمة مع إشارة DAPI. في بعض النوى، تغطي إشارة EdU جميع الكروموسومات، بينما في النوى الأخرى، تُترجم إشارة EdU إلى واحد إلى اثنين من البانكتا الساطعة، على الأرجح على الكروموسوم X، الذي يتكرر في وقت متأخر من مرحلة S. إشارة EdU من 30 دقيقة ناجحة وضع العلامات المترجمة إلى ما يقرب من نصف النوى في منطقة pregenetor.
في حين أن هذه التقنية تعمل باستمرار في أنواع الحيوانات البرية الشباب الكبار، جزء كبير من تزاوج 5 أيام hermaphrodites القديمة فشل في تسمية في نبض EdU 30 دقيقة. ويمكن تقدير مدة G2 من خلال تحليل النسبة المئوية للنيات في المرحلة M التي هي إيجابية EdU على مدار الوقت، مما يسمح بحساب متوسط والحد الأقصى للمدة G2. ويمكن تقدير مدة G2 وG1 من النسبة المئوية لجميع نوى المنطقة قبلية التي هي إيجابية EdU، مما يسمح بحساب الحد الأقصى للمدة من المراحل مجتمعة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر استخدام نفس الدفعة من أطباق EdU لتقليل التباين بين التجارب.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التلطيخ بالأجسام المضادة الإضافية أو الإجابة على أسئلة إضافية حول دورة الخلية أو مصير الخلية أو مسارات الإشارة. لا ننسى أن العمل مع النظير مبيدات النوى و parafermeldahyde يمكن أن تكون خطرة، وأن الاحتياطات، مثل ارتداء قفازات النيترول، ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
