Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в биологии, такие как, как различные типы клеток генерируются и организованы в структуры высшего порядка с конкретными функциями. Основным преимуществом этого метода является то, что он облегчает эффективную очистку клеток, присутствующих при низком изобилии в зрительной системе Drosophila для транскриптомического и геномного анализа. Во вторник шестой недели протокола, за 45 минут до вскрытия, получить один флакон папаин порошок от четырех градусов по Цельсию и инкубировать его при комнатной температуре.
Далее, отложите Полный Шнайдер в средних, или CSM, в трубке Eppendorf при комнатной температуре, чтобы добавить в порошок папайна позже. За пять-десять минут до вскрытия используйте шприц, чтобы добавить комнатную температуру CSM во флакон папаина непосредственно через крышку до концентрации 100 единиц на миллилитр. Чтобы смешать, сначала инвертировать флакон, чтобы захватить любой порошок застрял на внутренней стороне крышки, а затем пипетки содержимое вверх и вниз.
После смешивания реагентов, довести воду до 37 градусов по Цельсию в стакане в водяной бане. Затем поместите флакон в стакан в течение 30 минут, чтобы активировать папаин и убедитесь, что флакон не плавает. В то время как папаин инкубирует, получить алицитат протеолитического фермента смесь из морозильной камеры и инкубировать его при комнатной температуре.
После 30 минут активации, инкубировать папаин при комнатной температуре. Во вторник шестой недели, вскрыть поставил ученик мозги в холодной CSM с чистыми типсами. Вскрыть как можно больше мозгов, как это возможно в 10 минут и объединить мозги в свежей капле холодной CSM.
Отрежьте оптические доли, ущипнув на стыке оптической доли и центрального мозга. Затем добавьте доли в нижней части микротрубки, содержащей 500 микролитров 1x RS. Одна микротрубка для экспериментальной ткани и одна для отрицательной контрольной ткани. Держите трубки на льду.
Рассекаете как можно больше долей за один час. Бассейн вскрытых оптических долей в одной микротрубки для устранения потери тканей во время передачи между микротрубки. Тщательно удалите 1x RS из микротрубки с вскрытых оптических долей с помощью P200 пипетки, оставляя достаточное решение для покрытия долей.
Аккуратно добавьте 500 микролитров 1x RS в сторону трубки. Пусть доли оседают на дне трубки, затем пипетки до 200 микролитров. Изгнать смесь, наблюдать доли движущихся и позволяют доли поселиться снова.
Для двух образцов, aliquot 600 микролитров активированных, комнатной температуры папаин в микротрубку. Далее создайте решение диссоциации. Добавьте 4,2 микролитера протеолитического фермента комнатной температуры в смесь 600 микролитров раствора папаина, чтобы получить окончательную концентрацию 0,18 ВУ на миллилитр и смешать раствор, смешав его вверх и вниз.
Затем аккуратно удалите 1x RS из каждого образца и добавьте 300 микролитров раствора диссоциации в доли. Инкубировать образцы при 25 градусах по Цельсию. 1000 об/мин в течение 15 минут в микротруборубе ThermoMixer.
На 5 и 10 минут времени точек, остановить ThermoMixer и пусть доли опускаются на дно микротрубки. Pipette до 200 микролитров раствора и перемешать. После 15-минутной инкубации подождите, пока доли осядут на дно, и осторожно удалите раствор диссоциации из долей, не нарушая доли.
Вымойте доли два раза с 1x RS. Аккуратно добавьте 500 микролитров 1x RS, не нарушая доли. Затем осторожно пипетки до 200 микролитров и аккуратно изгнать раствор. Позвольте долям опуститься на дно и повторить.
Далее, мыть каждый образец два раза с 500 микролитров CSM. Аккуратно удалите CSM и добавьте в трубку еще 200 микролитров CSM. Используя P200 пипетки, нарушить ткани, трубы вверх и вниз без пены, пока раствор является однородным.
Используя пипетку P200, фильтруйте подвеску клетки через 30-метровую сетчатую крышку в 5-миллилитровую трубку факса на льду. И убедитесь, что вся подвеска проходит. Добавьте 500 микролитров CSM для полоскания микротрубки диссоциации.
И отфильтруй раствор в трубку факса. Наконец, осторожно смей предел факса трубки. Соберите раствор под сетчатым фильтром с P200 и добавьте его в остальную часть подвески в трубке факса.
Конфокаловая микроскопия иммуно окрашенных долей с антителами, специфическими против DsRed и GFP, а также антитела 24B10 в качестве эталона для нейропилов Ламины и Медуллы, подтвердила, что L3 является единственным типом клеток, помеченным как DsRed, так и GFP в оптической доле. Были зафиксированы факты из 100 000 событий, из которых 29,9% всех событий являются потенциальными синглетами. После того, как дублеты в клетках разного размера были закрыты на основе детализации и размера, остальные одиночные клетки, L3 нейроны, появились как плотные кластеры в P1, который был хорошо отделен от фоновых клеток.
После этой процедуры, другие методы, такие как РНК-сек или ATAC-seq могут быть выполнены для решения биологических вопросов путем анализа экспрессии генов или хроматина организации, соответственно. Этот метод значительно продвигает способность исследователей исследовать генетические механизмы, лежащие в основе развития и функции сложных тканей с использованием зрительной системы Drosophila в качестве модели.
