Иммунофторесценция является основным методом, который может помочь ответить на ключевые вопросы в области надпочечников о надпочечников зонации, клеточной идентичности и функции. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет изучать несколько белков при сохранении морфологии надпочечниковой ткани. Чтобы удалить надпочечники мурина, разрезать вокруг окружающих жировой ткани и поместить железу в один колодец 24-многоярдовой пластины, содержащей свежие PBS на льду.
Передача железы на чашку Петри или стеклянную поддержку под рассечением микроскопа и использовать два 25 калибровочных игл для удаления прилегающих жировой ткани. Когда весь жир был удален, исправить ткани в 4%paraformaldehyde при четырех градусах по Цельсию с качания в течение двух часов. В конце инкубации, промыть железу с тремя 15-минутные моет при четырех градусах по Цельсию в один-два миллилитров свежего PBS за стирку.
После последнего мытья, обезвоживать железу в двух последовательных погружений этанола при четырех градусах по Цельсию с качания в течение двух часов на инкубацию. Чтобы подготовить надпочечников ткани для обработки, оберните железу в марлю и заключить надпочечников в ткань встраивания кассеты. Затем поместите кассету в банку с 70%этанолом в течение четырех градусов по Цельсию хранения до обработки.
Для обработки ткани вставьте кассету в тканевой процессор для обработки, как указано в таблице. В конце программы перенесите кассету на встраиваемую станцию, наполненную расплавленным парафином 65 градусов, и используйте пару типсов, чтобы развернуть марлю. Аккуратно перенесите надпочечники в соответствующее положение в центре основания встраиваемой формы и вылейте расплавленный парафин на железу.
Затем осторожно переместите встраиваемую форму в охлаждающий лоток, чтобы облегчить затвердевание парафина. Перед разделом с помощью роторного микротома, этикетка серии слайдов микроскопа и заложить слайды на 37 градусов по Цельсию слайд теплее. Выпредельте около 450 микролитров автоклавного типа одной ультра чистой воды на каждую горку и установите на каждую горку секцию, разрезая толщину микротома до пяти микрометров.
Загрузите встроенную ткань на режущей блок и опустите парафиновый блок до тех пор, пока образец не будет на уровне лица с краем лезвия микротомы. Вращая колесо руки с устойчивым ритмом, выполните начальную обрезку, чтобы удалить парафин и разоблачить надпочечниковую ткань. Затем приобрети пять микрометровых секций до конца надпочечников, используя типсы для переноса каждого участка в каплю воды на одну из предварительно помеченных горок по мере ее сбора.
Подтвердив наличие тканей в секциях с помощью микроскопии, высушите горки на горячей тарелке в течение примерно двух часов и выпекайте их хотя бы на ночь на подносе при температуре 37 градусов по Цельсию, пока не будет видно больше воды. После высыхания храните слайды в слайд-боксе при комнатной температуре. Для поиска иммунофлюоресценции антигена, де-парафинизировать слайды с двумя пятиминутными 100%-хилен погружения, а затем регидратации в нисходящем этанола и воды погружения серии.
После погружения воды перенесите горки на металлический держатель слайда и поместите держатель в стакан кипящего 0,01 молярного цитрата на горячую тарелку в течение 10 минут. В конце инкубации снимите стакан с горячей пластины и дайте ему остыть в течение 20 минут, заботясь о том, чтобы все надпочечники по-прежнему покрыты буфером. Когда стакан охлаждается, перенесите слайды в банку Coplin в течение трех 10 минут моет в свежем PBS с нежным качания.
После последней стирки тщательно протрите поверхность каждого слайда, не повреждая секции тканей и используйте гидрофобный маркер, чтобы сделать круг вокруг каждого раздела. Поместите горки во увлажненной камере и быстро добавьте не менее 50 микролитров блокирующего раствора в каждый раздел для часовой инкубации при комнатной температуре. В конце блокирования инкубации, мыть слайды три раза в свежем PBS в течение пяти минут за стирку с качания и вернуть слайды в камеру.
Затем добавьте основной коктейль антител, представляющий интерес для каждого раздела для ночной инкубации при четырех градусах цельсия. На следующее утро, мыть образцы с тремя 15-минутные моет в свежем PBS за стирку и этикетки слайды с соответствующим вторичным раствором антител в течение одного часа защищены от света. В конце инкубации, мыть образцы с тремя 15-минутные моет на рокер защищен от света, маркировка ядер секций с DAPI в течение семи минут при комнатной температуре защищены от света после последней стирки.
После трех пятиминутных PBS моет с качания, добавить 60 микролитров монтажного агента подходит для иммунофторесценции вдоль поверхности одного стекла крышки на образец и слегка нажмите каждый слайд ткани раздел вниз на крышку стекла, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Затем положите каждую горку в темный контейнер для лечения при комнатной температуре, по крайней мере за 24 часа до получения изображений. Во время процесса удаления жира, очень важно, чтобы не позволить надпочечников высохнуть, как обезвоживание может повредить структуру тканей.
После успешного удаления окружающих жировой ткани, надпочечники должны быть легко обнаружить без лишних видимых жиров. Иммуностимулирование секций надпочечников, как попродемонстрировано, выявляет ядерный стероидогенный фактор, окрашивающий адренокортикальные клетки, окрашивание гидроксилазы тирозина медуллярных клеток, окрашивание ядер нестероидогенных клеток внешней капсулы и совместное окрашивание адренокортическими и медуллярными клетками. При попытке этой процедуры, важно помнить, что мышь надпочечники малы, и что их позиции несколько переменной делает их обнаружение трудно.
Поэтому крайне важно иметь четкое представление о площади во время вскрытия. Эти процедуры являются основными методами для изучения надпочечников in vivo. После этого могут быть проведены дополнительные методы иммуностимулятора для удовлетворения конкретных научных потребностей.
После своего развития, иммуностимулятор проложил путь для исследователей в области биомедицинских наук, чтобы исследовать экспрессию белка in situ, полезный инструмент во многих дисциплинах и областях.
