Этот метод может помочь с исследованием мембранных белков, таких как транспортеры и каналы. Информация о потере оборота субстрата сравнивает белковую активность и специфичность и различные физиологические и патологические состояния. Основным преимуществом этого метода является то, что он сводит к минимуму потенциальные изменения сдвига и условия буфера без хлорида.
И значительно повышает точность определения скорости оборота за счет более точных мембранных потенциальных измерений. Соберите элементы для кулачных шагов. К ним относятся два микро-капиллярных пипетки советы, резкое лезвие и раздвижной калипер.
Для электрода есть серебряная проволока, песчаная бумага и три молярного раствора хлорида калия под рукой. Кроме того, этанол и вода для очистки и питания постоянного тока. Продолжить работу с двумя микро-пипетки советы.
Начните с наконечника, который будет содержать буфер. Поместите второй наконечник рядом с первым. Перемести второй наконечник, так что при вставке его узкая часть будет простираться не менее пяти миллиметров в узкую часть первой.
Отметте положение, в котором будет прикреплен первый буфер, содержащий наконечник. Затем используйте калипер для измерения длины микро-агар соляной мост электрода. Используйте лезвие, чтобы сократить кончик до соответствующей длины.
Очистите срезаную поверхность этанолом, за которым последует вода. Далее, получить длину около восьми сантиметров серебряной проволоки для электрода. Очистите проволоку на салфетках этанолом, за которым последует вода.
После очистки используйте песчаную бумагу, чтобы сгладить поверхность на один сантиметр длиной на одном конце. Эта проволока с ее сглажеженным концом готова к электрохимическому покрытию. Положите сглаженый конец в раствор хлорида калия с другим концом, подключенным к источнику питания для покрытия.
При покрытии отключите электрод и очистите его водой. После высыхания определите длину, которая позволяет ему проникать в микро капиллярный кончик как можно глубже. Отрежьте электрод с неокрашенной стороны до соответствующей длины.
Теперь, перейти к подготовке соленого раствора с агарозой. В колбе, содержащей воду растворить хлорид калия и использовать магнитный мешалка для оказания помощи смешивания. После снятия мешалки добавить агарозу в колбу.
Возьмите колбу в микроволновую печь и нагреть его, чтобы расплавить агарозу при температуре около 100 градусов по Цельсию. Возьмите его, чтобы визуально проверить, что агароза растворяется полностью. После того, как агароза растворяется пипетка 10 микролитров в микро-капилляр медленно, чтобы избежать пузырьков воздуха.
Важно тщательно пипетки агар солевой раствор в микро капиллярный кончик, особенно при высоких концентрациях агара. Если не сделано должным образом пузырьки воздуха легко производятся в кончике и блокировать электрический поток. После снятия наконечника с пипетки нажмите электрод в него.
Убедитесь, что электрод проникает в соляной раствор. Когда электрод находится при комнатной температуре, подключите его к эталону электрода в усилитель. Поддержите эталонный электрод, чтобы его можно было опустить в пластиковый контейнер с одним миллилитров буфера.
Затем окуните электрод соленого моста в раствор. Нанесите напряжение и убедитесь, что есть текущий ответ, прежде чем продолжить. Если тест будет успешным, отключите электроды.
При необходимости храните электрод соленого моста, окуная его в трехялолярный раствор хлорида калия. Затем подготовьтесь к буферу, содержащем пластиковый наконечник. Возьмите микро капиллярный наконечник и определите точку в двух сантиметрах от узкой части.
Используйте нагревательный провод, чтобы согнуть трубку на 90 градусов в этом положении. Острым ножом вырезали трубку в пяти миллиметрах от изогнутой. Очистите область, которая была сокращена с этанолом следуют воды.
Прежде чем приступить, используйте световой микроскоп с шкалой для измерения диаметра отверстия на кончике. Затем перемести пипетки рядом с контейнером растворителя и еще одним буфером. Pipette три микролитров растворителя в и из кончика.
Затем заполните наконечник измерения тремя микролитров буфера. Теперь извлечения соляного моста из раствора хлорида калия. Подключите наконечник измерения буфером к электроду соляного моста.
Подключите электрод соляного моста и эталонный электрод к усилителю. На этом этапе приостанавливаем электрод соляного моста в буферный раствор со эталонным электродом. Представление конфигурации для эксперимента находится в этой схеме.
В ходе эксперимента мембрана сформируется в конце буфера, содержащего пипетку. Соберите данные, чтобы найти емкость мембраны. Сделайте это, применяя треугольный переменный сигнал напряжения для создания прямоугольной реакции переменного тока.
Далее, найти проводимость и напряжение при нулевом токе. Автоматизировать применение рампы напряжения в диапазоне от минус 50 до 50 милливольт и зафиксировать ток. Подходит для линейной функции данных.
Склон является проводимость, x-перехват напряжения при нулевом токе. После этого удалите наконечник измерения с соляного моста. Заполните новый наконечник измерения буфером, отрегулируйте его под различное значение рН, чтобы настроить протонный градиент по всей мембране.
Восстановить экспериментальный набор с новым наконечником измерения и электродами для того, чтобы повторить измерения. Вот репрезентативные текущие записи напряжения в присутствии градиента рН. И, при отсутствии градиента рН.
Линии представляют собой линейное подгонки к данным. Сдвиг точки пересечения х оси для различных значений рН прогнозируется уравнением Нернста. Эти данные представляют собой сдвиг в мембранном потенциале во времени для стандартного электродела хлорида серебра в белом, и микро-агар солевой мост электрод в черном.
Электрод моста соли агара был более стабилен с максимальным переносом меньш чем 5 милливольт над 300 секундами измерения. В этом участке потенциального сдвига в качестве функции градиента рН два электрода, как видно, ведут себя значительно по-разному по мере увеличения градиента рН. Скорость оборота протонов может быть найдена и сравнена для двух типов электродов.
Здесь номера оборота протона определенные для митохондриального uncoupling протеина одного UCP1 измеренного электродом моста соли сравненным к стандартному электроду. Имеются также данные по аналогично подготовленной ОГП3. Тарифы кажутся более точными с электродом моста соли агара.
При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы электрод проникает в раствор соли агара. Соляной мост должен также окунуться в буферный раствор. Наконец, убедитесь, что раствор соли агара не содержит пузырьков воздуха.
