Поскольку АТФ является важным клеточным мессенджером, мы разработали метод, который позволяет нам измерять связывание АТФ с его рецепторами с высокой точностью. Используя FRET между производными нуклеотидов и флуоресцентно меченными белками, мы можем контролировать связывание нуклеотидов с интактными функциональными рецепторами в режиме реального времени и с отличным пространственным разрешением. Мы используем этот метод, чтобы понять влияние клеточного метаболизма на чувствительный к АТФ калиевый канал, который участвует в определенных формах диабета.
Чтобы провести эксперимент с мембраной без крыши, сначала используйте пару щипцов, чтобы вырвать небольшой фрагмент из покровного стекла с трансфицированными клетками и промыть фрагмент PBS. Если покровное стекло предварительно покрыто полилизином, поместите фрагмент на дно 35-миллиметровой тарелки, содержащей два миллилитра PBS, и держите ультразвуковой аппарат с трехмиллиметровым зондом на три-пять миллиметров над образцом, пульсирующий с мощностью 50 Вт и амплитудой от 20 до 40% в течение 200-500 миллисекунд, чтобы разблокировать ячейки. Если покровные шликеры не покрыты предварительным покрытием, после промывки PBS окуните фрагмент в пробирку, содержащую 0,1% поли-L-лизина, примерно на 30 секунд, прежде чем вскрывать клетки с помощью краткой обработки ультразвуком, как показано на рисунке.
Перенесите обработанный ультразвуком фрагмент в покрытую стеклянным дном 35-миллиметровую тарелку, содержащую два миллилитра раствора для ванны, и установите чашку на инвертированный микроскоп, оснащенный объективом с высокой числовой апертурой и 60-кратным погружением в воду. Убедитесь, что порт камеры микроскопа подключен к спектрографу последовательно с высокочувствительной ПЗС-камерой, и используйте перистальтический насос для перфузии камеры ванны с буфером со скоростью потока от 0,5 до одного миллилитра буфера в минуту. Чтобы идентифицировать фрагменты мембраны без крыши, экспрессирующие меченый ANAP канал, просмотрите образец, чтобы найти мембраны с флуоресцентными каналами.
Частично задействуйте маску спектрометра между портом камеры на микроскопе и спектрографом. Тень маски появится на изображении камеры. Получите яркое поле и флуоресцентное изображение непокрытой мембраны, чтобы можно было выбрать интересующую область для анализа.
Поднесите наконечник микрообъемной перфузионной системы близко к непокрытой мембране. Чтобы получить изображение флуоресценции ANAP, возбуждайте мембрану 385-нанометровым светодиодом через 390/18-нанометровый полосовой фильтр возбуждения и 416-нанометровый краевой дихроичный, собирая излучаемый свет через 400-нанометровый длинночастотный эмиссионный фильтр. Включите маску спектрометра и убедитесь, что излучаемый свет пропускается.
Совместите интересующую область с прорезью маски спектрометра. Задействуйте решетки спектрометра. Когда решетки установлены, свет, рассеиваемый спектрометром, будет проецироваться на чип ПЗС-камеры для получения спектральных изображений.
Изображения сохранят пространственную информацию в измерении Y. Измерение X будет заменено длиной волны. При перфузии буферным раствором без нуклеотидов получите одно или несколько экспозиций от 0,1 до десяти секунд для последующей коррекции и нормализации данных, собранных в течение остальной части эксперимента.
Затем нанесите диапазон концентраций ТНП АТФ в растворе ванны, чтобы установить кривую реакции на концентрацию, перфузируя каждый раствор в течение не менее одной минуты, чтобы обеспечить достижение устойчивого состояния и получить воздействие для каждой концентрации. После каждой концентрации промывайте АТФ ТНП раствором для ванны без нуклеотидов в течение не менее одной минуты, прежде чем получить изображение воздействия после обработки. Чтобы провести эксперимент с флуорометрией с пластырем, сначала вытащите пластырные пипетки из толстостенных капилляров из боросиликатного стекла до сопротивления от 1,5 до 2,5 мегаом при заполнении раствором пипетки.
Затем перенесите покровное стекло с трансфицированными ячейками в 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном, содержащую два миллилитра раствора для ванны, и установите чашку на перевернутый микроскоп. Перфузируйте камеру ванны раствором для ванны и определите клетку, экспрессирующую каналы, меченные ANAP. Слегка надавите на пластырь-пипетку и поместите пипетку в ванну.
Прижмите пипетку к мембране клетки и аккуратно отсосите для достижения уплотнения в гигаом. Чтобы удалить пластырь, быстро отодвиньте держатель пипетки от заплатанной ячейки. Поднесите наконечник пластыря к кончику перфузионной системы и убедитесь, что пластырь находится в щели маски спектрометра.
Затем нанесите ТНП АТФ и соберите спектры изображений. На этих изображениях можно наблюдать типичный фрагмент мембраны из клетки HEK293T, экспрессирующей чувствительные к АТФ калиевые каналы, помеченные оранжевым флуоресцентным белком. На этом спектральном изображении чувствительных к АТФ калиевых каналов, помеченных ANAP, в непокрытой мембране из клетки HEK293T, подвергшейся воздействию пяти микромолярных TNP ATP, можно наблюдать две области высокой интенсивности, которые соответствуют пиковому излучению ANAP и TNP АТФ.
Окончательный спектр может быть получен путем вычитания усредненного фонового спектра из усредненной области спектра интереса. Здесь можно наблюдать снижение пиковой флуоресценции ANAP после многократного воздействия. Пиковая флуоресценция от нескольких воздействий в отсутствие ТНП АТФ была подогнана к одному экспоненциальному распаду.
Затем эти данные были использованы для исправления артефактов фотообесцвечивания. Здесь показаны репрезентативные спектральные изображения с непокрытой мембраны, полученные из клетки, экспрессирующей чувствительные к АТФ калиевые каналы, меченные ANAP, в отсутствие и присутствии TNP ATP. Наблюдение за скорректированными спектрами излучения показывает четкое разделение между донорным и акцепторным флуоресцентным излучением.
На этом рисунке показаны репрезентативные токи и спектры чувствительных к АТФ калиевых каналов, помеченных ANAP, из типичного эксперимента по флуорометрии с патч-зажимом. Спектры излучения скорректированы на фон и обесцвечивание, как показано для непокрытых мембран. Будьте осторожны с элементами управления, чтобы убедиться, что флуоресцентный сигнал специфичен для вашего рецептора.
Убедитесь, что ваше изобилие быстрое, эффективное и полное, и держите экспозицию как можно короче. Этот метод отвечает на вопросы о занятости рецепторов и о том, как она связана с функцией. Другие методы FRET, используемые с аналогичной установкой, могут исследовать индуцированные лигандом подтверждающие изменения в рецепторе.
