Автоматизированный протокол MeshAndCollect был разработан для объединения серийной кристаллографии со стандартным сбором данных вращения для измерения малых кристаллов из образцов шайбы. Метод сначала определяет положение кристаллов, установленных на том же держателе образца, чтобы затем направить сбор частичного набора данных, который впоследствии будет объединен и использован для решения структуры. MeshAndCollect является убедительным, как это позволяет делать эксперименты быстро и с той же установки, структура решения, лиганд скрининга, и все, что с крошечными кристаллами.
Метод совместим с VMX синхротронной балки, идеально оснащенной высоким фотоном flex, диаметром небольшого луча и детектором быстрой перезагрузки. Во-первых, подключись к расширенной информационной системе базы данных белковой кристаллографии лучевой линии и выберите MX.Log с номером эксперимента и паролем из формы А. Далее выберите Shipment Add New и заполните запрашиваемую информацию.
Выберите Добавить Частично и заполнить соответствующие данные. Выберите Add Container, выберите шайбу SC3 и заполните требуемую информацию, включая позиции держателей образца в шайбе. В экспериментальной загоне загрузите шайбу в пробу сменщика и обратите внимание на ее положение.
Затем войдите в информационную систему базы данных белковой кристаллографии. Выберите «Подготовьй эксперимент», найдите отгрузку, выберите Next и укажите положение луча и шайбы в смене образца. Войдите в программное обеспечение управления лучом с экспериментальным номером и паролем, предоставленным на форме A.
Нажмите sync для синхронизации программного обеспечения управления лучом с информационной системой для базы данных белковой кристаллографии лучевой линии. Используйте программное обеспечение для управления лучом, чтобы смонтировать держатель образца на гониометр. Затем нажмите правой кнопкой мыши в области смены выборки и выберите образец горы.
Выберите центральную кнопку, а затем три клика по центру посередине края кончика петли. Сохраните центрированную позицию, выбрав Save. В рамках Advanced добавьте визуальную переориентацию рабочего процесса в очередь сбора данных.
Затем запустите рабочий процесс, нажав на коллекционные очереди. Далее выберите одну из сохраненных центральных позиций, нажав на нее. Нажмите еще раз на центральную кнопку, а затем три клика центр в середине начала ствола цикла.
Сохраните вторую позицию, нажав на Save. А затем нажмите на Продолжить. После того, как рабочий процесс выравнивает плоскость держателя образца с оси вращения гониометра, центр держатель образца снова где-то в середине сетки.
Ориентируйте держатель образца так, чтобы лицо сетки перпендикулярно направлению рентгеновского луча, вращая ось омега с помощью программного обеспечения управления лучом. В программном обеспечении управления лучом нажмите на меню высадки диафрагмы и выберите значение. Затем нажмите на значок инструмента сетки, чтобы принести вверх окно инструмента сетки.
В примере программного обеспечения управления лучом нарисуйте сетку левым нажатием и перетаскиванием мыши по области, содержащей кристаллы на держателе образца. Чтобы сохранить сетку, нажмите на кнопку плюс в окне инструмента сетки. В поле разрешения программного обеспечения управления лучевой линией введите разрешение, в котором должны быть собраны изображения дифракции.
Если не известно никакой предварительной информации о качестве дифракции кристаллов, рекомендуется значение от двух до 2,5. Выберите MeshAndCollect во вкладке Расширенный сбор данных. Добавьте его в очередь и нажмите Соберите очередь.
В окне параметра используйте зависящие от луча параметры по умолчанию. В эксперименте, описанном здесь, параметры по умолчанию 0,037 секунд времени экспозиции на точку сканирования сетки, 100% передачи, и один градус колебаний на линию сканирования сетки. Нажмите Продолжить.
Сканирование сетки работает и дифракционные изображения, собранные в каждой точке сетки анализируются и ранжируются в соответствии с силой дифракции с программным обеспечением Dozer. После анализа Dozer генерируется тепловая карта и автоматически назначается порядок последующих частичных сборов данных на основе силы дифракции. Наконец, нажмите Продолжить запуск частичного сбора данных.
MeshAndCollect, реализованный в MXCuBE, использовался для сбора частичных наборов данных дифракции из небольших кристаллов Cerulean, расположенных на том же держателе образца, в котором визуальная идентификация кристаллов была затруднена. Для проверки держателя выборки сетка была нарисована над центром цикла сетки, и на основе тепловой карты Dozer было автоматически собрано 85 наборов данных частичной дифракции. Они были индивидуально интегрированы, а затем объединены для получения набора данных с 99,8%полнотой при разрешении 1,7 ангстремов.
Как и ожидалось, кристаллическая структура Cerulean может быть решена путем молекулярной замены с помощью набора данных, генерируемых. После уточнения, R работы 22,8% и R бесплатно 25,4%были получены. Супер положение ранее определяемой структуры показывает глобальный RMSD на c-альфа позиции 0,1 ангстремов.
Для проектов, где оптимизация фазы роста кристалла, MeshAndCollect предоставляет возможность получить полный набор данных на основе комбинации этих аморфных частичных наборов данных, полученных из небольших кристаллов. Этот метод проложил путь для структурных биологов, чтобы решить структуру из частей образца, где только несколько десятых микро кристаллов не могут быть произведены.
