Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития завода в отношении распределения регулятивных фитогормонов роста. С помощью генетически закодированных биосенсоров FRET, например nlsGPS1, который обнаруживает гиббереллины, можно измерить динамическое распределение важных соединений в тканях арабидопсиса в клеточном растворе. Как правило, люди, новые в этом вопросе будет бороться, потому что анализ БИОсенсоров FRET включает в себя соотношения изображения, которая увеличила шум и дополнительные аналитические шаги по сравнению с намерением метрической визуализации.
Начните с посева около 20 стерилизованных семян арабидопсиса на 1/2 Мурашиге и Скуге или MS agar квадратных пластин. Печать пластин с поры хирургической лентой и оберните их алюминиевой фольгой в течение одного-трех дней инкубации при четырех градусах по Цельсию для стратификации. Для корневой визуализации перенесите пластины в камеру роста в вертикальной ориентации в течение трех дней в указанных условиях.
Для темного hypocotyl, передать пластины в камеру роста в течение одного-четырех часов световой импульс для синхронизации прорастания. Затем оберните пластины алюминиевой фольгой и поместите их в камеру роста в вертикальной ориентации в течение трех дней. Для устойчивых измерений состояния добавьте 50 микролитров макетного раствора в чистый слайд микроскопа и аккуратно поместите три ядерных локализованных датчика восприятия гиббереллина один или nlsGPS1, выражают саженцы на слайде.
Затем пятно капли вакуумной смазки на каждом углу чистой крышкой скольжения и аккуратно место для покрытия скольжения по саженцам. Тщательно добавляя дополнительное решение макет, чтобы удалить любые пузырьки воздуха по мере необходимости. Перед гиббереллином четыре или GA4 лечения, использовать 20 миллилитров шприц заполнены вакуумной смазки и оснащены модифицированными 200 микролитр пипетки кончик с одним миллиметровым диаметром открытия обратить равномерно слоистых три с половиной сантиметра в длину на два с половиной сантиметра широкий прямоугольник на чистой стеклянной горке.
Добавьте 50 микролитров макетного раствора в центр прямоугольника и используйте чистые типсы, чтобы поднять nlsGPS1, выражаю саженцы нижней частью их котилендона для тщательной передачи в макет раствора. Поместите крышку скольжения пятнистый с вакуумной смазкой, как только что продемонстрировали в центре прямоугольника вакуумной смазки и тщательно заполнить резервуар с дополнительными макет раствора, не нарушая саженцы. Затем приобретуте изображения саженцев на конфокальцавном микроскопе, оснащенном соответствующими лазерами для захватывающих CFP и YFP для выполнения резонансной визуализации передачи энергии Forster.
Для GA4 для лечения, удалить слайд со сцены микроскопа и установить таймер в течение 20 минут. Немедленно удалите макет раствора с правой стороны крышки скольжения при добавлении 17 микролитров одной четверти жидкости MS дополнены одним микро-моляр GA4 в левую сторону крышки скольжения до тех пор, пока все макет решение было заменено. Затем поместите стеклянную горку обратно на сцену микроскопа и подождите еще 10 минут, прежде чем приобрести изображение после обработки GA4.
Чтобы настроить курс времени для ткани, представляющие интерес, добавьте 200 микролитров макетного раствора в центр перфузионого канала липкой слайда и аккуратно поместите саженцы nlsGPS1 в макет раствора, как это было продемонстрировано. Используйте типсы, чтобы аккуратно разместить крышку скольжения по саженцам с помощью задней части типсов, чтобы мягко нажать на внешние края крышки скольжения, пока она не образует сильную связь с липким материалом на периферии липкой слайд. Далее используйте два 0,8 миллиметра внутреннего диаметра локоть Luer разъемы и 0,8 миллиметра внутреннего диаметра кусок силиконовой трубки для подключения липкой скольжения к 20-миллиметровый шприц заполнен макет раствора и подключить слайд к розетке контейнера для сбора оттока раствора.
Аккуратно угнетайте поршень, чтобы выдать достаточное количество раствора камере, чтобы убедиться, что нет пузырьков воздуха, а затем загрузить шприц на программируемый шприц насос. Затем запустите насос, чтобы инициировать курс времени. Для лечения GA4 во время курса времени, приостановить насос, чтобы остановить перфузии и заменить макет буфера, содержащего шприц со шприцем заполнены одной четверти жидкости MS дополнены GA4.
Для анализа 3D-изображений импортируют файлы в программу анализа изображений IMARIS и открывают мастера поверхностей. Установите фоновое вычитание до трех микрон и пороговое значение по умолчанию. Во время сегментации ядер позаботьтесь о том, чтобы не включать многие ядра с тусклой флуоресценцией, так как рацион сигнала к шуму объекта с почти фоновыми уровнями сигнала будет слишком низким для анализа соотношения.
Затем маскировать каналы выбросов CFP и FRET на основе поверхностей, созданных с использованием выброса YFP. Используйте расширение среднего коэффициента интенсивности XT для расчета соотношения выбросов донора, разделенного донорским выбросом донора между средними значениями интенсивности отдельных поверхностей в двух каналах. Чтобы окрасить отдельные поверхности с коэффициентом выбросов nlsGPS1, выберите цветовое кодирование со статистикой и установите среднее соотношение интенсивности в качестве типа статистики.
В соответствии с иконой статистики экспортируйте соотношения отдельных значений из таблицы и копируйте и вставьте значения в электронную таблицу для графического представления данных. В корне арабидопсиса градиент коэффициента выбросов nlsGPS1 свидетельствует о низких уровнях GA4 в меристематических и делениях и высоких уровнях ГА в поздней зоне удлинения. В отличие от этого, градиент коэффициента выбросов не наблюдается в неответственных корнях nlsGPS1, что свидетельствует о том, что эндогенный градиент GA4 не является артефактом.
Градиент коэффициента выбросов nlsGPS1 также образуется в темно-выращенных гипокотилях с низким уровнем котилендона и типичным крючком и высокими уровнями в быстро удлиненной базальной области гипокотила. В отличие от этого, градиент коэффициента выбросов не наблюдается в неответняющих гипокотилях nlsGPS1. Кроме того, экзогенно поставляемый GA4 накапливается преимущественно в удлиненной зоне по сравнению с зоной деления корня арабидопсиса, что указывает на то, что nlsGPS1 может быть использован для изучения эндогенной и экзогенной га-шаблона.
Кроме того, анализ времени GA4 обработанных nlsGPS1 саженцев, показывает более быстрое накопление экзогенных GA4 в корневой удлинения так по сравнению с зоной деления. При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы избежать насыщенных пикселей во время количественной визуализации, чтобы сохранить параметры изображения постоянными и свести к минимуму дрейф и фокусные изменения вопросов во время перфузии образца. После этой процедуры разработаны методы, как изображения корни, растущие в корневой чип типа управления изобилие устройства могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как ГА градиенты изменения в Arabidopsis корень советы растут с разной скоростью или в ответ на стресс После его развития, этот метод проложил путь для исследований в области роста растений, чтобы изучить динамическое распределение gibberellins в дополнительных арабидопсии талиана тканей и органов.
