Этот протокол в травах непрерывное измерение генетических цепей в E.coli и расчет изменчивости сигнала и соотношения сигнала к шуму в отдельных бактериальных клетках для оценки производительности цепи. Основными преимуществами этой техники являются то, что она легко адаптируется к различным штаммам и лабораториям, требует минимальной подготовки и не имеет специального оборудования, и является относительно недорогой. Шум играет важную роль в определении функциональности биологических систем.
В настоящее время существует интерес к созданию крупномасштабных генных цепей. Эти системы могут быть ингибированы шумом Не забудьте высушить образцы хорошо, чтобы сохранить, что холод колодки на четыре градуса по Цельсию как можно дольше, и сократить и разделить части терпеливо и осторожно. Для подготовки бактерий к анализу прививают одну колонию от трансфицированной культуры E.coli.
Например, схема с репортером GFP. В стеклянной трубке, содержащей пять миллилитров бульона LB, его дополняют соответствующими антибиотиками. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия и 250 оборотов в минуту в трясущимся инкубаторе в течение двух часов, пока бульон не будет облачным.
В конце инкубации, спина вниз один миллилитр раствора разбавления в двух миллилитров мини микро центрифуги, и передачи 30 микролитров бактерий и весь объем раствора разбавления в новую двухми миллилитровую трубку. Затем инкубировать культуру в течение одного часа с встряхивания до посева от 40 до 60 микролитров этой подвески на M9 культуры пластин. Чтобы подготовить бактерии к анализу, привить одну колонию от трансфицированной культуры E.Coli.
Например, схема с репортером GFP в стеклянной трубке, содержащей пять миллилитров бульона LB, дополненная соответствующими антибиотиками. Выращиваем клетки при 37 градусах Цельсия и 250 оборотов в минуту в трясущимся инкубаторе в течение двух часов, пока бульон не будет облачным. В конце инкубации, спина вниз один миллилитр раствора разбавления в двух миллилитров мини микро центрифуги трубки и передачи 30 микролитров бактерий и весь объем раствора разбавления в новую двухми миллилитровую трубку.
Затем инкубировать культуру в течение одного часа с тряской. Для подготовки микроскопа пластины, смешать 112,5 миллиграммов низкоплавильного агара с 40 миллиграммов агара, и один миллилитр 2%casamino кислоты в 25 миллилитров Erlenmeyer колбу. Далее добавьте 8,92 миллилитров минимальной среды над внутренними губами 25 миллилитров колбы Erlenmeyer и микроволновой печи в результате решения в короткие, два-три секунды очередей.
Затем установите водяную баню до 55 градусов по Цельсию. Когда раствор будет ясным, поместите 25 миллилитровую колбу Erlenmeyer в водяную баню 60 градусов по Цельсию и дайте агару остыть до тех пор, пока его температура не упадет примерно до 45-50 градусов по Цельсию. В то время как агар охлаждения, очистить лаборатории скамейке с 70% этанола и гладкой кусок лабораторной ленты на очищенной скамейке.
Поместите одну стеклянную крышку скольжения на ленту и поместите вторую крышку скольжения рядом. Добавьте охлажденный агарный раствор к соответствующим антибиотикам и раствору. Налейте 1,5 миллилитров свежеприготовленного для геля раствора на крышку скольжения размещены над лентой и место второй крышкой скольжения на гель, заботясь, чтобы избежать пузырьков.
Верните Эрленмейера в ванну с горячей водой и накройте крышку квитанциями на 20 минут. Переверните крышку скользит в течение одного часа инкубации при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации снимите крышку со сухого геля и вырежьте небольшую площадку из агарозы.
Во время инкубации добавьте шесть капель микролитров подготовленной бактериальной суспензии в 35-миллиметровую тарелку и дайте каплям высохнуть не менее 15-30 минут. Затем аккуратно поместите площадку за один раз на одну каплю бактерий и позвольте образцам установить в течение 20 минут при комнатной температуре. Чтобы поместить агар кровать без размазывания образца, тщательно располагайте прохладную площадку на капельку с нежным постукиванием.
Чтобы изобразить образцы, удалите колбу из воды и дайте гель-раствору остыть до температуры тела. Налейте три миллиметра геля на периметр образца пластины. Когда агароза затвердевла, запечатать пластину с лентой и использовать 25 калибровочных иглы кусок несколько отверстий в ленту.
Затем поместите пластину вверх дном при четырех градусах по Цельсию, по крайней мере 30 минут, чтобы агароза полностью затвердеть, предотвращая при этом митоз клеток. В течение 24 часов используйте флуоресцентный конфокальный микроскоп, чтобы найти образец при самом низком увеличении и включить автоматическую фокусную систему микроскопа. Нанесите масло на соответствующую цель и используйте контроллер платформы для перемещения пластины, чтобы тщательно распределить масло.
Затем снова ввешите автоматический фокус и следуйте предложению по умолчанию для поперечных сечений шага для изображения образца. E.coli должен выглядеть как черные продолговатые формы на белом фоне. И динамический диапазон яркости должен показать всплеск в его центре.
Митозные события могут быть впервые обнаружены с помощью микроскопии флуоресценции через 30 минут. Хотя отдельные клетки может быть трудно обнаружить при низком увеличении. Бактериальные клеточные культуры, подготовленные при неправильном соотношении разбавления, могут демонстрировать неизменное количество клеток, а образцы, подготовленные без уплотнения пластин, могут проявлять чрезмерную усадку, что приводит к потере фокуса.
Клетки могут также indent гель в их поисках питательных веществ, в результате чего укладка бактериальных клеток друг на друга и ущерба для монослой клетки, эффективно предотвращая обнаружение клеток и надежное измерение флуоресцентного сигнала. Как показывают эти данные, этап деления ячейки не влияет на уровень шума, так как различные диапазоны области демонстрируют одинаковую тенденцию. Кроме того, никаких существенных изменений в соотношении сигнала к шуму между GFP и сверхкратным GFP не наблюдается, о чем свидетельствуют эти репрезентативные данные.
При выполнении этой процедуры, заботиться, чтобы определить правильное соотношение разбавления для бактериального штамма, используемого для эксперимента. Сравнение соотношения сигнала к шуму каждой регулируемой схемы с этой базовой линией позволяет получить лучшую схему производительности и может выявить интересные явления
