Внутриклеточные бактериальные сообщества, или IBCs, наблюдались у мышей, которые были даны экспериментальные инфекции мочевыводящих путей, или ИМП. Они также были замечены в отложениях мочи пациентов с ИМП человека. Техника, которую мы описываем сегодня, это способ изолировать одиночные МЦК от экспериментально инфицированных мышей.
Техника микропайптинга во рту является единственным доступным в настоящее время методом изоляции внутриклеточных бактерий от инфицированных мочевых пузырей мыши. Для подготовки стеклянных пипеток рот, твердо щепотку обоих концах стеклянной капиллярной трубки и равномерно повернуть середину трубки вперед и назад вдоль своей оси над открытым источником пламени. Когда стекло станет мягким, удалите капилляр из источника тепла и немедленно потяните стекло друг от друга.
Идеальная окончательная длина вытащил капилляров на три-пять сантиметров длиннее, чем unpulled капилляров для обеспечения соответствующего внутреннего диаметра для изоляции одного мочевого пузыря эпителиальных клеток. Когда стекло остынет, проверьте, если середина стеклянной капиллярной уже, и что интерьер трубки по-прежнему полые. Подбирая большой конец вытащил капилляров с одной стороны, использовать миппы, чтобы схватить капилляр в самой узкой точке, убедившись, что типсы обладают достаточной силой, чтобы сцепление капилляров твердо, не дробления его.
Быстро скрутить типсы, чтобы оснастки вытащил капилляров в самой узкой точке. Затем поместите капилляр размером с капиллет размером с рот в 100-миллиметровую чашку Петри и флуиф стерилизуем блюдо в течение 30 минут. Чтобы собрать мочевой пузырь, поместите мышь в положение на спине и стерилизовать область живота с 70%этанола.
Используя этанол-стерилизованные типсы и хирургические ножницы, сделайте первоначальный поперечный разрез поперечной кожи выше уретры открытия и расширьте разрез по диагонали к верхним конечностям мыши, чтобы создать V-образный разрез вдоль всей передней части мыши, которая подвергает содержимое брюшной полости. Используя новые стерилизованные инструменты, осторожно нажмите вниз на жировые прокладки вблизи тазовой области мыши, чтобы вызвать мочевой пузырь выступать и захватить открытый мочевой пузырь на вершине. Сохраняя твердое сцепление с мочевым пузырем, вырезать мочеточители и уретру, чтобы освободить мочевой пузырь и вставить кончик одного вала округлых типсов в отверстие мочевого пузыря, где он был просто инк отрезали.
Отпустите типсов захвата вершины и поддержания округлые типсы почти полностью закрыты, использовать вторую пару типсов мягко тянуть внешний конец рта мочевого пузыря от округлых типсов и вокруг и над другой кончик округлых типсов, чтобы превратить мочевой пузырь наизнанку. Затем используйте вторую пару типсов, чтобы мягко уговорить перевернутый мочевой пузырь от кончика типса в один миллилитр холодного PBS. И аккуратно соскребать внутренний эпителиальный слой клеток на внешней стороне перевернутого мочевого пузыря с двумя парами чистых типсов.
Когда все клетки были Царапины, вставьте unpulled конце вытащил стеклянный капилляр в резиновую вилку аспиратор трубки и плотно подходят узкий конец одного миллилитров пипетки кончик в другой открытый конец трубки. Плотно подходят узкий конец двух миллилитров аспирирующих пипетки в открытый, более широкий конец одного миллилитров пипетки отзыв и место Царапины подвески клеток под рассечение микроскопа. Используя увеличение от 20 до 40X, определите IBCs как большие флуоресцентные агрегаты и окуните тонкий конец стеклянной капиллярной трубы в свежую трубку PBS на одну секунду, чтобы уменьшить поглощение нежелательного объема через капиллярное действие.
Когда IBC интереса был расположен, медленно принести открытый конец капиллярной трубки к IBC и применить очень небольшую силу всасывания для аспирирующих пипетки для руководства МКБ в стеклянной капиллярной. Затем перемести капилляр в пустую 1,5-миллилитровую центрифугу и применить небольшое положительное давление, чтобы изгнать капельку и МКБ в трубку. В дополнение к подтверждению наличия одного изолированного МКБ в трубке коллекции с помощью рассеченного микроскопа, чистота изолированного МКБ может быть подтверждена конфокаленной микроскопией.
Изолированные клетки должны окрашиваться как для E.coli, так и для уроплакина и должны быть размером от 50 до 120 микрометров. После изоляции наличие и жизнеспособность бактериальных клеток в отдельном МКБ может быть подтверждено путем формирования единицы колонии количественной или количественной полимеразной цепной реакции для геномных эквивалентов. Примечательно, что неинфицированные эпителиальные клетки, изолированные тем же протоколом, не демонстрируют количественного количества бактерий.
Кроме того, количественный анализ обратной транскрипции полимеразной цепной реакции подтверждает наличие бактериальных генов в ряде индивидуально изолированных и объединились IBCs. Всегда убедитесь, что рот micropipette может забрать и изгнать жидкость легко. Не стесняйтесь менять капилляр или весь аппарат, если рот микропипют чувствует себя затуха.
Этот метод микропайптинга рта позволяет нам непосредственно и конкретно изучать внутриклеточные популяции, которые образуются во время экспериментального UTI. Без этого метода, эти внутриклеточные популяции будут загрязнены и превосходят по численности внеклеточных бактерий. Некоторые другие инфекционные агенты могут быть более легко аэрозолизированы или переданы, чем E.coli мы использовали в этом приложении.
Поэтому в этих случаях могут быть оправданы некоторые дополнительные элементы управления, такие как добавление фильтра или расширение труб в зависимости от используемого приложения. IBCs изолированы с помощью этого рта micropipetting метод может быть использован в других вниз по течению одного анализа клеток, таких как СРТПКР или РНК секвенирования.
