Здесь мы описываем протокол, использующий иммунофторесценцию, конфокаленовую микроскопию и компьютерный анализ для определения распределения синаптического белка относительно эталонного белка. Наш метод обходит присущую вариативность окрашивания иммунофлуоресценции с помощью соотношения, а не абсолютного уровня флуоресценции. Кроме того, с помощью этого метода можно проанализировать неоднородность распределения белка на разных уровнях.
От целых ломтиков мозга до областей мозга даже к югу от таких областей, как различные слои гиппокампа. Этот метод может быть адаптирован для определения распределения белка в различных тканях, кроме мозга и модельных систем, кроме мышей. Начните с мытья ранее изолированных и фиксированной мыши мозга, как описано в рукописи.
Затем перенесите мозг в 15-миллилитровую реакционной трубку с 30% сахарозой 0,1 молярного ПБ. Чтобы крио защитить мозг инкубировать его при 4 градусах по Цельсию в течение 48 часов или до тех пор, пока он тонет. После этого используйте острый лезвие, чтобы обрезать крио защищенный мозг в зависимости от области интереса. Затем поместите мозг в крио-форму и добавьте оптимальное подворье температуры резки, чтобы встроить его убедившись, чтобы избежать пузырьков и сориентировать мозг должным образом, чтобы иметь коронаную плоскость резки.
Поместите крио плесень в минус 80 градусов по Цельсию морозильник, пока он не заморожен твердых. Намонтировать замороженные ткани на крио микротоме и ждать, по крайней мере 15 минут до раздела, чтобы уравнотворить его до температуры микротома. Начните разрезать мозг на 25 микрометров толщиной корональных ломтиков.
Используйте стеклянный крюк к OCT первого ломтика тщательно, не касаясь ткани мозга. OCT будет прилипать к стеклянной крючок. Используйте стеклянный крюк, чтобы передать ломтик мозга в первый колодец.
Соберите три смежных ломтика на колодец в 24 хорошо пластины заполнены 0,1 молярного PB. Хранить ломтики при четырех градусах по Цельсию до окрашивания в течение двух недель. Для подготовки ломтиков для иммуноокрашивания используйте пластиковую трубу, чтобы удалить раствор ПБ из одного хорошо, не рисуя в ломтиках мозга. Затем используйте 1000 микролитров трубоубит, чтобы добавить 250 микролитров свежего ПБ, чтобы вымыть их излишних OCT.
Повторите эту стирку для каждого хорошо в то время, чтобы избежать высыхания ломтиками. Затем используйте пластиковую трубу, чтобы удалить ПБ раствор из первой колодец. Используйте 1000 микролитров пипетки, чтобы добавить 250 микролитров блокирующего буфера на хорошо работает хорошо хорошо снова.
Инкубировать тарелку при комнатной температуре на шейкере в течение трех часов. Во время инкубации добавьте 250 микролитров буфера антител на колодец в реакционной трубке. Затем используйте 2 микролитровый пипетки, чтобы добавить соответствующее количество антитела трубы его непосредственно в раствор и осторожно трубы вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать.
Затем вихрь это разбавленное антитело к неуверенным надлежащего смешивания. Работая хорошо, хорошо удалить блокирующий буфер с пластиковой трубой и добавить 250 микролитров первичного раствора антитела на колодец. Инкубировать пластину на шейкере при четырех градусах по Цельсию на ночь.
На следующий день удалить раствор антитела с пластиковым пипетки. Вымойте ломтики с 300 микролитров стирального буфера по одному на хорошо три раза десять минут каждый мыть на шейкер при комнатной температуре. Во время стирки, работая в темноте, разбавляют флюор на пару секунд антителом в реакционной трубке таким же образом, как это было ранее сделано с первичным антителом.
После завершения стирки удалите стиральный буфер с помощью пластиковой трубы и добавьте 250 микролитров вторичного раствора антител на колодец. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 90 минут. После завершения инкубации удалить раствор антитела с помощью пластиковой трубы.
Вымойте секции три раза с помощью стирального буфера два так же, как с мытьем буфера один. Во время этого мытья разбавить DAPI пятно в 0,1 молярного PB для достижения 1 до 2000 концентрации. После снятия стирального буфера с тарелки добавьте 250 микролитров раствора DAPI и инкубировать при комнатной температуре на шейкере в течение 5 минут.
После удаления раствора DAPI с помощью пластиковой трубы используйте 1000 микролитровую трубу, чтобы добавить 500 микролитров 0,1 молярного ПБ на колодец. Поместите слайд микроскопа под стереоскоп. Используйте тонкую кисть, чтобы добавить три отдельные капли 0,1 молярного PB на слайде.
С помощью кисти поместите один ломтик на каплю на слайде, а затем сгладить и сориентировать ломтики. После того, как все ломтики расположены правильно использовать бумажную ткань, чтобы удалить избыток ПБ и тщательно высохнуть без высыхания ломтиками полностью. Затем добавьте 80 микролитров встраиваемой среды на слайд и аккуратно накройте его крышкой скольжения для встраивания ломтиков мозга.
Обложка слайды, чтобы избежать воздействия света и оставить их высохнуть в дым капот в течение одного-двух часов, а затем хранить их в микроскоп слайд-бокс при четырех градусах по Цельсию, пока не готов к конфокальные микроскопии. После приобретения виртуальных тканей всего мозга ломтик для различных каналов, как описано в рукописи загрузить все отдельные каналы или одно изображение в FIJI, нажав файл, а затем открыть. Затем используйте инструмент выбора свободной руки, чтобы разграничить одно полушарие в канале DAPI.
Нажмите на редактировать, затем выбрать, а затем создать маску, чтобы создать маску выбранного региона. Затем нажмите на анализ, а затем измерить частицы, чтобы определить средняя интенсивность флуоресценции для отдельных каналов. Обязательно выберите отдельные каналы для определения средних значений интенсивности флуоресценции для каждого канала.
После этого скопировать среднее интенсивность флуоресценции для отдельных каналов в электронную таблицу. Для определения среднего интенсивности флуоресценции для отдельных каналов в области интересов разграничить область с помощью инструмента свободного выбора руки. После окрашивания с DAPI, которые пятна ядер мозга разделы имеют пунктуатный узор и регионов с высокой плотностью клеток ярче, чем регионы с низкой плотностью клеток.
Окрашивание антителом Mover выявило неоднородное распределение с яркими горячими точками и тусклыми областями по всему мозгу, где как синаптофизин выявил более однородное распределение. Наложение изображений показало дифференциальное распределение красной флуоресценции, указывающей на белок Mover по сравнению с зеленой флуоресценцией, указывающей на синаптофизин. После количественного анализа были определены значения интенсивности флуоресценции для различных каналов в полушариях и в областях, представляющих интерес для Mover и Synaptophysin.
Соотношения значений флуоресценции движения к значениям флуоресценции синаптофизина показывают неоднородное распределение Mover с областями высокого и низкого уровня Mover по отношению к синаптической пузырькам. Относительное изобилие Mover соотношение в одной области интересов по сравнению с этим во всем полушарии и переведены в процент показал, сколько Mover присутствует в одной области, представляющих интерес по сравнению со средним. Относительное изобилие Mover было определено для различных слоев в под полях гиппокампа.
Три области, представляющие интерес, количественно определены путем сопоставления соотношения в соответствующих слоях с соотношением соответствующего полушария. Эта процедура может быть легко адаптирована и в сочетании с различными методами визуализации, такими как микроскопия супер разрешения, чтобы дополнительно определить субклеточное распределение белка интереса. Этот метод также может быть применен к различным модельным системам, таким как генетически модифицированные или обработанные наркотиками животные.
Это может позволить сравнительный подход в различных экспериментальных условиях или даже видов.
