Aqui descrevemos um protocolo que emprega imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador para determinar a distribuição de proteína sináptica em relação a uma proteína de referência. Nosso método contorna a variabilidade inerente das manchas de imunofluorescência usando uma razão em vez de níveis absolutos de fluorescência. Além disso, com este método você pode analisar a heterogeneidade da distribuição de proteínas em diferentes níveis.
De fatias cerebrais inteiras a regiões cerebrais até sub-regiões, como as diferentes camadas do hipocampo. Esta técnica pode ser adaptada para determinar a distribuição de proteínas em diferentes tecidos além do cérebro e sistemas de modelos diferentes dos camundongos. Comece lavando cérebro de rato previamente isolado e fixo, como descrito no manuscrito.
Em seguida, transfira o cérebro para um tubo de reação de 15 mililitros com 30% de sacarose 0,1 pb molar. Para crio proteger o cérebro incuba-lo a 4 graus celsius por 48 horas ou até afundar. Depois disso, use uma lâmina afiada para aparar o cérebro protegido criogeno dependendo da área de interesse. Em seguida, coloque o cérebro em um molde criogeno e adicione o composto de temperatura de corte ideal para incorporá-lo certificando-se de evitar bolhas e orientar o cérebro corretamente de modo a ter um plano coronal de corte.
Coloque o molde criogeno no congelador de menos 80 graus celsius até que esteja congelado. Monte o tecido congelado no microtome crio e espere pelo menos 15 minutos antes da seção para equilibrá-lo à temperatura do microtoma. Comece a cortar o cérebro em fatias coronais de 25 micrômetros de espessura.
Use um gancho de vidro para o OCT da primeira fatia cuidadosamente sem tocar no tecido cerebral. O OCT vai grudar no gancho de vidro. Use o gancho de vidro para transferir a fatia cerebral para o primeiro poço.
Colete três fatias adjacentes por poço em uma placa de 24 poços preenchidas com PB molar 0,1. Armazene as fatias a quatro graus celsius até coloração por até duas semanas. Para preparar as fatias para a coloração imuno, use uma tubulação de plástico para remover a solução PB de um poço sem desenhar as fatias cerebrais. Em seguida, use uma tubulação de 1000 micro litros para adicionar 250 microliters de PB fresco para lavá-los de excesso de OUTUBRO.
Repita esta lavagem para cada poço no momento para evitar secar as fatias. Em seguida, use uma tubulação de plástico para remover a solução PB do primeiro poço. Use um pipet de 1000 microliteres para adicionar 250 microliters de tampão de bloqueio por bem funcionando bem novamente.
Incubar a placa em temperatura ambiente em um agitador por três horas. Durante a incubação adicione 250 microliters de tampão de anticorpos por poço a um tubo de reação. Em seguida, use um pipet de 2 microliter para adicionar a quantidade apropriada de tubos de anticorpos que o tubo diretamente na solução e gentilmente tubos para cima e para baixo várias vezes para misturar.
Em seguida, vórtice este anticorpo diluído para a mistura adequada. Trabalhando bem, remova bem o tampão de bloqueio com uma tubulação de plástico e adicione 250 microliters de solução de anticorpos primários por poço. Incubar a placa em um shaker a quatro graus celsius durante a noite.
No dia seguinte, remova a solução de anticorpos com uma tubulação de plástico. Lave as fatias com 300 microliters de tampão de lavagem um por poço três vezes dez minutos cada lavagem em um agitador à temperatura ambiente. Durante a lavagem, trabalhando no escuro, diluir o fluor para um segundo anticorpo em um tubo de reação da mesma forma que anteriormente feito com o anticorpo primário.
Depois de concluída a lavagem, remova o tampão de lavagem com uma tubulação plástica e adicione 250 microliters de solução de anticorpos secundários por poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 90 minutos. Após a incubação concluída, remova a solução de anticorpos com uma tubulação de plástico.
Lave as seções três vezes com tampão de lavagem dois da mesma forma que com o tampão de lavagem um. Durante esta lavagem diluir a mancha DAPI em 0,1 pb molar para alcançar uma concentração de um a 2000. Depois de remover o tampão de lavagem da placa adicione 250 microliters de solução DAPI e incubar à temperatura ambiente no agitador por 5 minutos.
Depois de remover a solução DAPI com uma tubulação de plástico use uma tubulação de 1000 microliteres para adicionar 500 microliters de PB molar de 0,1 por poço. Coloque um slide de microscópio sob um estereóscópio. Use uma escova fina para adicionar três gotas separadas de 0,1 molar PB no slide.
Usando o pincel coloque uma fatia por gota no slide e, em seguida, achate e oriente as fatias. Depois de todas as fatias serem posicionadas corretamente use um tecido de papel para remover o excesso de PB e seque cuidadosamente sem secar completamente as fatias. Em seguida, adicione 80 microliters de incorporação de meio no slide e cubra-o cuidadosamente com um deslizamento de tampa para incorporar as fatias cerebrais.
Cubra os slides para evitar a exposição à luz e deixe-os secar no capô da fumaça por uma a duas horas e, em seguida, armazene-os em uma caixa de slides de microscópio a quatro graus celsius até estar pronto para microscopia confocal. Depois de adquirir tecidos virtuais de toda a fatia cerebral para diferentes canais, como descrito no manuscrito, carregue todos os canais ou uma imagem em FIJI clicando no arquivo e depois abra. Em seguida, use a ferramenta de seleção manual gratuita para delinear um hemisfério no canal DAPI.
Clique em editar e, em seguida, selecione a máscara para criar uma máscara da região selecionada. Em seguida, clique em analisar e, em seguida, medir partículas para determinar a intensidade média de fluorescência para canais únicos. Certificando-se de selecionar canais únicos para determinar os valores médios de intensidade de fluorescência para cada canal.
Depois disso, copie a intensidade média da fluorescência para os canais únicos em uma planilha. Para determinar a intensidade média da fluorescência para os canais únicos em uma área de interesse, delineie a área com a ferramenta de seleção manual gratuita. Após a coloração com DAPI, que mancha seções cerebrais de núcleos têm um padrão pontual e regiões com alta densidade celular são mais brilhantes do que regiões com baixa densidade celular.
A coloração com anticorpo Mover revelou distribuição heterogênea com áreas de hot spot brilhantes e áreas mais fracas em todo o cérebro, onde como a Sinaptofisina revelou distribuição mais homogênea. Uma sobreposição de imagens mostrou a distribuição diferencial da fluorescência vermelha indicando proteína mover comparou fluorescência verde indicando Sinápsia. Após a análise de quantificação, os valores de intensidade de fluorescência para diferentes canais nos hemisférios e em todas as áreas de interesse foram determinados tanto para mover quanto para a sinácia.
As razões dos valores de fluorescência do motor para os valores de fluorescência sináptica mostram a distribuição heterogênea do Mover com áreas de altos e baixos níveis de Mover em relação às vesículas sinápticas. A proporção relativa do Mover a razão em uma área de interesse em comparação com a do hemisfério e traduzida em uma porcentagem mostrou o quanto o Mover está presente em uma área de interesse em relação à média. A abundância de Mover relativo foi determinada para diferentes camadas nos sub-campos do hipocampo.
As três regiões de interesse são quantificadas comparando a razão nas respectivas camadas com a razão do hemisfério correspondente. Este procedimento pode ser facilmente adaptado e combinado com diferentes técnicas de imagem, como microscopia de super resolução para determinar adicionalmente a distribuição subcelular da proteína de interesse. Esta técnica também pode ser aplicada a diferentes sistemas de modelo, como animais geneticamente modificados ou tratados com drogas.
Isso pode permitir uma abordagem comparativa em diferentes condições experimentais ou mesmo espécies.
