Цель расширенных дрожжей один гибрид анализов является выявление набора транскрипционных факторов, которые связываются с последовательностью ДНК интерес. Преимущество этого метода заключается в том, что расширенные дрожжи одномио гибридных анализов может оценить более 1000 транскрипционных факторов в одном эксперименте. И наоборот, иммунопреципиентация хроматина оценивает только один транскрипционный фактор за один раз.
Этот метод представляет собой ключевой инструмент для функциональной геномики для определения репертуара транскрипционных факторов, которые связываются с генными промоутерами и усилителями, и для выявления измененного фактора транскрипции, связывающего некодирующие варианты. Демонстрация процедуры будет Dr.Xing Лю postdoc из моей лаборатории. Оттепель дрожжей глицерола фондовых пластин с TF добычу массива на льду.
Resuspend дрожжей с помощью 12 каналов пипетки и перейти к следующему шагу в течение 1 до 3 минут. Чтобы обнаружить дрожжи в Sc минус триптофан прямоугольные пластины, использовать высокую плотность массива робота, чтобы выбрать multiwell 96 пластин в качестве источника, 96 агар пластин в качестве мишени, и 96 длинных контактных колодок. Pin колодки не являются многоразовыми и должны быть отброшены.
Выберите Spot Многие программы, чтобы сделать две копии на 96 хорошо пластины. Не используйте рециркуляции или пересмотреть варианты, чтобы избежать обратного загрязнения замороженных запасов. Кроме того, выберите вариант кружиться вверх и вниз в источнике, чтобы смешать дрожжи.
Следуйте инструкциям, где и когда разместить пластины и позволить роботу обнаружить дрожжи в Sc минус триптофан прямоугольные пластины. Сумка пятнистый массив и инкубировать его агар сторону вверх при 30 градусов по Цельсию в течение 2 до 3 дней. Для создания 384 массивов колонии в Sc минус триптофан прямоугольные пластины, выберите 96 агар пластин в качестве источника, 384 агар пластины в качестве цели, и 96 коротких контактных колодок.
Затем выберите единую программу 1:4. Таким образом, четыре 96 колоний будут объединены в одну 384 колонии пластины. Не используйте рециркуляции или пересмотреть варианты, чтобы избежать загрязнения между различными пластинами.
Сумка пластины и инкубировать пятнистый 384 колонии массив агар стороне при 30 градусов по Цельсию в течение 2 дней. Для создания 1536 массивов колонии в Sc минус триптофан прямоугольные пластины, выберите 384 агар пластин в качестве источника, 1536 агар пластин в качестве мишени, и 384 коротких контактных колодок. Затем выберите программу анализа 1:4 с одним исходным кодом.
Цель состоит в том, чтобы скопировать каждую колонию на четыре колонии, чтобы получить четырехкратные. Используйте рециркуляции и пересмотреть варианты, поскольку это включает в себя копирование каждой колонии 4 раза. Следуйте инструкциям робота и позвольте роботу обнаружить дрожжи в тарелках перед мешками и инкубацией пятнистой 1536 колонии массив агар стороны вверх на 30 градусов по Цельсию в течение 3 дней.
Чтобы усилить массив 1536 колоний в прямоугольных пластинах Sc минус триптофан, выберите 1536 агарных пластин в качестве источника, 1536 агарных пластин в качестве мишени и 1536 коротких контактных колодок. Выберите программу Replicate Many, чтобы воспроизвести от 3 до 4 копий. Используйте опцию рециркуляции и повторного использования, но выкинуть площадку при переключении на другую пластину массива, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Позвольте роботу усилить массив колонии 1536 в прямоугольных пластинах Sc минус триптофан. Наконец, мешок пластин и инкубировать пятнистый 1536 колонии массив агар стороны на 30 градусов по Цельсию в течение 3 дней, чтобы использовать для спаривания шагов. Чтобы подготовить ДНК приманки штамм газонов для спаривания, месте ДНК дрожжей приманки штаммов на Sc минус uracil и гистидин пластины и расти в течение 3 дней при температуре 30 градусов по Цельсию.
Streak дрожжей в 15 сантиметров Sc минус uracil и гистидин пластины с помощью стерильной зубочистки, так что каждая пластина подходит от 12 до 16 различных штаммов. Инкубировать пластину один день при 30 градусах по Цельсию. На следующий день, полоса дрожжей в 15 сантиметров Sc минус uracil и гистидин пластины с помощью стерильной зубочистки, так что каждая пластина подходит 4 различных штаммов.
Инкубировать пластину в течение одного дня при 30 градусах по Цельсию. После инкубации, соскребать дрожжи с помощью стерильной зубочистки, убедившись, что не царапать любой агар. Добавьте дрожжи в 1,5 миллилитровую трубку с 500 микролитров стерильной воды.
Теперь добавьте от 10 до 15 стерильных стеклянных бусин и дрожжевой суспензии на прямоугольную пластину YAPD. Встряхните тщательно во всех направлениях в течение одной минуты, чтобы обеспечить дрожжи распространяется по всей тарелке. Переверните тарелку немедленно, и нажмите так, чтобы шарики пошли на крышку.
Удалите и переработайте бисер. Сумка пластины и инкубировать их агар стороны вниз в течение 1 до 2 дней при 30 градусах по Цельсию. Затем приступайте к шагу спаривания.
Чтобы спаривать приманку ДНК дрожжей и штаммы массива TF, перенесите массив TF в прямоугольную пластину YAPD с роботом. Выберите 1536 агар пластины в качестве источника и цели, и 1536 короткий контактный колодки. Выберите программу Replicate Many.
Выберите 4 исходные пластины и рециркуляции и пересмотреть варианты. Каждая пластина массива TF может быть использована для передачи от 3 до 4 пластин YAPD. Пластины массива TF, используемые для спаривания, должны быть от 2 до 3 дней, но не более того, так как спаривание может быть неэффективным.
Для переноса газона штамма приманки ДНК на пластины YAPD, уже содержащие массив TF, выберите 1536 агар пластины в качестве источника и цели и 1536 короткий контактный колодки. Выберите программу Replicate Many. Используйте случайные смещения в источнике с радиусом около 0,6 миллиметра, чтобы избежать принятия дрожжей из того же места и выбрать Mix на цель для облегчения контакта между штаммами дрожжей.
Используйте газон, содержащий штаммы приманки ДНК в качестве источника, и пластины YAPD, содержащие пятнистый массив TF в качестве мишени перед мешками пластин и инкубации их агар сторону вверх на 30 градусов по Цельсию в течение одного дня. Для выбора диплоидных дрожжей, выберите 1536 агар пластины в качестве источника и цели, и выберите 1536 короткий контактный колодки. Выберите программу Replicate.
Выберите Mix на источнике и на цели. Разрешить роботу передать мякоть дрожжей из пластин YAPD в Sc минус uracil и триптофан пластины перед мешками пластин и инкубации их агар сторону вверх при температуре 30 градусов по Цельсию в течение 2 до 3 дней. Теперь выберите 1536 агар пластин в качестве источника и цели и 1536 короткий контактный колодки.
Выберите программу Replicate. Передача диплоидных дрожжей из Sc минус uracil и триптофан пластин для считывания прямоугольных 3-AT и X-Gal содержащие пластины с помощью робота. Сумка пластины и инкубировать их агар стороны при 30 градусов по Цельсию на срок до 7 дней.
Для штаммов приманки ДНК с высокой активностью репортера фона, сфотографировать на дни 2, 3 и 4. В противном случае, фотографировать в дни 4 и 7. Держите пластины массива TF при комнатной температуре и копируйте снова через 7 дней для нового раунда скрининга.
Чтобы проиллюстрировать тип результатов, которые могут быть получены с помощью расширенных дрожжей одногигиверных анализов, промоутер регионов CCL15 и IL17F генов были проверены на массив из 1086 человеческих TFs. Промоутер CCL15 является примером не-автоактивной приманки ДНК, где взаимодействия, даже слабые, могут быть легко обнаружены. Промоутер IL17F является примером автоактивной приманки ДНК с неравномерной активностью фонового репортера, где можно обнаружить некоторые взаимодействия, в то время как для нескольких TFs, неясно, является ли активность репортера выше, чем фон.
Есть несколько проблем, которые могут возникнуть при выполнении расширенных дрожжей одно-гибридных анализов. В этом случае колонии слишком малы и не передаются. Как правило, примерно 95% колоний добычи TF демонстрируют нормальный рост.
В этом примере, нет роста дрожжей в части пластины. Этот вопрос, как правило, связаны с неудачей в шаге спаривания, если 1536 контактная панель не в состоянии установить контакт с дрожжами в ДНК приманки штамм газон, в массиве TF, или в спаривания пластины. В этих двух примерах взаимодействия не обнаруживаются.
Эта проблема часто связана либо с непреднамеренными инактивирующими мутациями в генах репортеров, в частности с Лаком, либо с слишком высокой самоактивностью, маскировочной взаимодействия. В этом случае пластина представляет случайные синие пятна, которые часто связаны с бактериальным загрязнением. Самое главное, что нужно учитывать, это надлежащая подготовка пластины.
Убедившись, что все компоненты добавляются и что высота агара является равномерной, как и все последующие шаги зависят от этого. Хотя большинство реагентов не являются опасными, важно носить перчатки во все времена, чтобы избежать загрязнения образцов и пластин. Как и в любом анализе связывания ДНК, важно проверить взаимодействия, выявленные с помощью функциональных анализов, таких как анализы репортеров, нокдаун транскрипционные факторы или нокаут, а затем измерение экспрессии гена-мишени.
Этот метод позволил идентифицировать транскрипционные факторы, которые регулируют гены, участвующие в конкретных биологических процессах, а также транскрипционные факторы с альтернативной привязкой к некодирующих связанных с болезнью вариантов.
