המטרה של בדיקות שמרים חד-היברידיות משופרות היא לזהות את קבוצת גורמי התמלול הנקשרים לרצף DNA של עניין. היתרון של טכניקה זו הוא כי שמרים משופרים אחד היברידית assays יכול להעריך יותר מ 1000 גורמי שעתוק בניסוי אחד. לעומת זאת, אימונופרציפציה כרומטין מעריך רק גורם שעתוק אחד בכל פעם.
שיטה זו מהווה כלי מפתח עבור גנומיקה תפקודית כדי לזהות את הרפרטואר של גורמי שעתוק הנקשרים מקדמי גנים משפרי ולזהות גורם שעתוק שונה מחייב וריאנטים שאינם קידוד. הדגמת ההליך תהיה ד"ר שינג ליו פוסט-דוק מהמעבדה שלי. להפשיר את צלחות מלאי גליצרול שמרים עם מערך טרף TF על קרח.
השתמשו מחדש בשמרים באמצעות פיפטה של 12 ערוצים והמשיכו לשלב הבא תוך 1 עד 3 דקות. כדי לזהות את השמרים ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, השתמש ברובוט מערך בצפיפות גבוהה כדי לבחור 96 צלחות multiwell כמקור, 96 צלחות אגר כמטרה, ו 96 רפידות סיכה ארוכות. רפידות סיכה אינן ניתנות לשימוש חוזר ויש להשליך אותן.
בחר את התוכנית ספוט רבים כדי ליצור שני עותקים לכל 96 גם צלחת. אין להשתמש באפשרויות המיחזור או לבקר שוב כדי למנוע זיהום אחורי של המניות הקפואות. כמו כן, בחר את האפשרות להסתחרר למעלה ולמטה במקור כדי לערבב את השמרים.
בצע את ההוראות איפה ומתי למקם את הצלחות ולאפשר לרובוט לזהות את השמרים לתוך Sc מינוס טריפטופן צלחות מלבניות. לארוז את המערך המנוקד ולהדגירה אותו בצד אגר עד 30 מעלות צלזיוס במשך 2 עד 3 ימים. כדי ליצור 384 מערכי מושבה ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, בחר 96 צלחות אגר כמקור, 384 צלחת אגר כמטרה, ו 96 רפידות סיכה קצרות.
לאחר מכן בחר את תוכנית המקור היחיד של המערך 1:4. בדרך זו, ארבעה 96 לוחות מושבה יתאחדו לצלחת מושבה אחת 384. אין להשתמש באפשרויות המיחזור או לבקר שוב כדי למנוע זיהום בין צלחות שונות.
לארוז את הצלחות ותדגר את הצד המנוקד של מערך 384 המושבות אגר ב-30 מעלות צלזיוס למשך יומיים. כדי ליצור 1536 מערכי מושבה ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, בחר 384 צלחות אגר כמקור, את צלחות אגר 1536 כיעד, ו 384 רפידות סיכה קצרות. לאחר מכן בחר בתוכנית המקור הבודדת של 1:4.
המטרה היא להעתיק כל מושבה לארבע מושבות כדי להשיג פי ארבעה. השתמש באפשרויות המיחזור והבקרה מחדש מכיוון שזה כרוך בהעתקת כל מושבה 4 פעמים. בצע את ההוראות של הרובוט ולאפשר לרובוט לזהות את השמרים לתוך הצלחות לפני אריזה ודגירה של צד מערך המושבה המנוקד 1536 אגר למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.
כדי להגביר את מערך המושבה 1536 ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן, בחר 1536 צלחות אגר כמקור, 1536 צלחות אגר כמטרה, ו 1536 רפידות סיכה קצרות. בחר בתוכנית 'שכפל רבים' כדי לשכפל 3 עד 4 עותקים. השתמש באפשרות מיחזור ובקר שוב אבל לזרוק את הפנקס בעת מעבר לצלחת אחרת של המערך, כדי למנוע זיהום צולב.
אפשר לרובוט להגביר את מערך המושבה 1536 ב- Sc מינוס לוחות מלבניים טריפטופן. לבסוף, שקית הצלחות הדגירה הבחין 1536 המושבה מערך אגר בצד למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים כדי להשתמש עבור מדרגות הזדווגות. כדי להכין את מדשאות זן פיתיון DNA להזדווגות, לזהות את זני פיתיון שמרי DNA על צלחת Sc מינוס uracil והיסטידין ולגדול במשך 3 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.
רצף את השמרים לתוך 15 ס"מ Sc מינוס uracil וצלחת היסטידין באמצעות קיסם סטרילי, כך שכל צלחת מתאימה 12 עד 16 זנים שונים. דגירה הצלחת יום אחד ב 30 מעלות צלזיוס. למחרת, רצף את השמרים לתוך 15 ס"מ Sc מינוס uracil וצלחת היסטידין באמצעות קיסם סטרילי, כך שכל צלחת מתאימה 4 זנים שונים.
דגירה את הצלחת ליום אחד ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, מגרדים את השמרים באמצעות קיסם סטרילי, ומוודאים לא לגרד אגר. מוסיפים את השמרים לצינור 1.5 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של מים סטריליים.
עכשיו להוסיף 10 עד 15 קדילי זכוכית ותליית שמרים על צלחת מלבנית YAPD. לנער ביסודיות לכל הכיוונים במשך דקה אחת כדי להבטיח את השמרים מתפשטים לאורך הצלחת. הפוך את הצלחת מיד, והקש כך חרוזים ללכת למכסה.
מוציאים וממחזרים את חרוזים. שקית הצלחות דגירה אותם בצד אגר למטה במשך 1 עד 2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, המשיכו לשלב ההזדווגות.
כדי להזדווג עם פיתיון הדנ"א של השמרים וזנים במערך TF, העבר את מערך ה- TF לצלחת מלבנית YAPD עם הרובוט. בחר את צלחת אגר 1536 כמקור ואת היעד, ואת כרית סיכה קצרה 1536. בחר בתוכנית 'שכפל רבים'.
בחרו 4 לוחות מקור ואת אפשרויות המיחזור והבחינה מחדש. ניתן להשתמש בכל לוחית מערך TF להעברת 3 עד 4 לוחות YAPD. לוחות מערך TF המשמשים להזדווגות חייבים להיות בני יומיים עד שלושה ימים, אך לא יותר מכיוון שהזדווגות עשויה להיות לא יעילה.
כדי להעביר את הדשא של זן פיתיון DNA לצלחות YAPD שכבר מכילות את מערך ה- TF, בחר את צלחת הגר 1536 כמקור ואת המטרה ואת כרית הסיכה הקצרה 1536. בחר בתוכנית 'שכפל רבים'. השתמש בהיסט אקראי במקור עם רדיוס של כ 0.6 מילימטרים כדי למנוע נטילת שמרים מאותה נקודה ובחר לערבב על היעד כדי להקל על מגע בין זני שמרים.
השתמש במדשאה המכילה את זני פיתיון ה- DNA כמקור, ואת לוחות YAPD המכילים את מערך TF המנוקד כמטרה לפני אריזת הצלחות ודגירה אותם בצד אגר עד ב 30 מעלות צלזיוס ליום אחד. לבחירת שמרים דיפלואידים, בחרו את צלחת הגר 1536 כמקור ואת המטרה, ובחרו את כרית הסיכה הקצרה 1536. בחר את התוכנית שכפול.
בחר ערבב במקור ובמטרה. אפשר לרובוט להעביר את השמרים המוארים מצלחות YAPD ל- Sc מינוס uracil וצלחות טריפטופן לפני אריזת הצלחות ודגירה בצד אגר למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2 עד 3 ימים. עכשיו, בחר את צלחות אגר 1536 כמקור ואת היעד ואת כרית סיכה קצרה 1536.
בחר את התוכנית שכפול. מעבירים את שמרי הדיפלואידים מ-Sc מינוס uracil וצלחות טריפטופן ל-3-AT ו-X-gal המלבניים המכילים צלחות באמצעות הרובוט. לארוז את הצלחות דגירה אותם בצד אגר עד 30 מעלות צלזיוס עד 7 ימים.
עבור זני פיתיון DNA עם פעילות כתב רקע גבוה, לצלם בימים 2, 3, ו 4. אחרת, צלם בימים 4 ו-7. שמור את לוחות מערך TF בטמפרטורת החדר והעתק שוב לאחר 7 ימים לסיבוב הקרנה חדש.
כדי להמחיש את סוג התוצאות שניתן להשיג באמצעות מראות שמרים חד-היברידיים משופרים, אזורי האמרגן של הגנים CCL15 ו- IL17F הוסנו מול מערך של 1086 TFs אנושיים. מקדם CCL15 הוא דוגמה לפיתיון דנ"א לא אוטומטי, שבו ניתן לזהות בקלות אינטראקציות, אפילו חלשות. מקדם IL17F הוא דוגמה לפיתיון דנ"א אוטואקטיבי עם פעילות כתב רקע לא אחידה שבה ניתן לזהות אינטראקציות מסוימות, בעוד עבור מספר TFs, לא ברור אם פעילות הכתב גבוהה מהרקע.
ישנן מספר בעיות שעלולות להתרחש בעת ביצוע בדיקות משופרות שמרים היברידית אחת. במקרה זה, המושבות קטנות מדי ולא הצליחו לעבור. בדרך כלל, כ-95% מהמושבות לטרף TF מציגות צמיחה תקינה.
בדוגמה זו, אין צמיחה שמרים בחלק של הצלחת. בעיה זו קשורה בדרך כלל לכישלון בשלב ההזדווגות אם כרית סיכה 1536 אינו מצליח ליצור קשר עם השמרים במדשאת זן פיתיון DNA, במערך TF, או בצלחת ההזדווגות. בשתי דוגמאות אלה, לא מזוהות אינטראקציות.
בעיה זו קשורה לעתים קרובות או מוטציות לא מכוונות בגנים הכתב, בפרט LacZ, או autoactivity גבוה מדי כי להסוות אינטראקציות. במקרה זה, הצלחת מציגה כתמים כחולים אקראיים אשר קשורה לעתים קרובות לזיהום חיידקי. הדבר החשוב ביותר שיש לקחת בחשבון הוא הכנת צלחת נכונה.
ודא כי כל הרכיבים מתווספים כי גובה אגר הוא אחיד כמו כל השלבים הבאים תלויים בכך. למרות שרוב reagents אינם מסוכנים, חשוב ללבוש כפפות בכל עת, כדי למנוע זיהום של דגימות וצלחות. כמו בכל בדיקת איגוד DNA, חשוב לאמת את האינטראקציות שזוהו באמצעות בדיקות תפקודיות כגון בדיקות עיתונאיות, הפלת גורם שעתוק או נוקאאוט, ואחריו מדידת ביטוי של גן היעד.
שיטה זו אפשרה זיהוי של גורמי שעתוק המווסתים גנים המעורבים בתהליכים ביולוגיים מסוימים, כמו גם גורמי שעתוק עם קשירה חלופית לגרסאות הקשורות למחלות שאינן קידוד.
