Этот протокол помогает людям анализировать эндотелиальной морфологии клеток, и выражение молекул в регионах, под различными жидкости стрижки стресса. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает прямую оценку сосудистых эндотелиальных клеток при различном стрессе стрижки жидкости. При выполнении этой процедуры ключевыми шагами являются использование свежеприготовленного параформальдегида и выполнение хорошей перфузии.
Начните эту процедуру с анестезии 12-недельной мыши C57BL/6, как описано в текстовом протоколе. Подтвердите правильную анестезию, аккуратно щипав хвост. Лента лапы мыши к стопке бумажных полотенец, с клейкой лентой.
Поддерживайте кожу мыши типсами и вырежьте кожу ножницами от живота до верхней части грудной клетки. Откройте брюшную полость, ниже грудной клетки, острыми ножницами. Поднимите грудину типсами и разрежьте диафрагму.
Затем отрежьте грудную клетку, чтобы разоблачить грудную полость. Отрежьте вена кавы чуть выше печени с ножницами. Давление пронизывает артериальное дерево в течение пяти минут, с предварительно охлажденным нормальным солевым раствором, содержащим 40 единиц на миллилитр гепарина, через левый желудочек, пока легкие и печень не побледнели.
Затем пролизавиться с предварительно охлажденным 4%paraformaldehyde в PBS в течение четырех минут. Удалить все мышцы, органы и жир, пока аорта подвергается. Поместите мышь под рассечение микроскопа.
Используйте тонкие типсы и пару тонких ножниц, чтобы разоблачить аорту четко под рассекающим микроскопом, и удалить соединительной ткани вдоль аорты, как можно более чисто. Рассекают грудную аорту от сердца до целиакии ствола с помощью тонких ножниц. Поместите аорту в шестициметровую клеточную культуру с помощью PBS.
Разрежьте аорту продольно, сначала вдоль меньшей кривой, а затем используйте микросцисоры, чтобы разрезать три ветви аортальной арки, включая инноту, левую общую сонную артерию, и левую подклавианскую артерию вдоль большей кривой до тех пор, пока не будет выполнен прямой сегмент. Permeabilize аорты с 1%polyoxyethylene октил фенил эфир, в PBS в течение 10 минут. Затем блокируйте аорту с 10%нормальной сывороткой козы в трис-буферном солевом растворе, содержащем 2,5%полисорбат 20 в течение одного часа при комнатной температуре, в 12 хорошо клеточной культуре пластины.
Далее инкубировать аорту в блокирующий буфер, содержащий пять граммов на миллилитр кролика анти-VCAM1, и пять граммов на миллилитр крысы анти-VE-кадхерин, на ночь при четырех градусах по Цельсию. После полоскания образца три раза с стиральным раствором, применять флуоресценции конъюгированных вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре, сохраняя в темном месте. Промыть еще три раза в стиральном растворе.
Counterstain аорты с DAPI в течение 10 минут, сохраняя в темном месте. Затем промыть окрашенные аорты три раза в стиральный раствор. Поместите аорту на крышку скольжения с люменальной поверхности вниз, и переместить его медленно, чтобы антифада монтажа раствор, который ранее был сброшен на крышку скольжения.
Аккуратно растянуть аорту, чтобы сохранить образец плоским. Инвертировать крышку скольжения и положить его на стеклянную горку. Позаботьтесь, чтобы избежать пузырьков воздуха между образцом и стеклом.
Изучите аорту с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Анализ интенсивности цвета различных каналов из нужной области на изображениях en face, с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus. En лица иммунофторесценции окрашивания изображения сосудистых эндотелиальных клеток из мыши аорты показаны.
En лицо иммунофлуоресценции сосудистой клеточной адгезии белка один, и выражение с VE-кадерин в качестве эндотелиального маркера, показаны при различных моделей потока из разных областей мыши аорты. DAPI был также counterstained, чтобы показать ядра клеток для лучшей визуализации. При просмотре стеков под микроскопом эндотелиальные и гладкие мышечные клетки легко отличить по морфологии ядер клеток.
Ядра эндотелиальных клеток имеют овальную форму и больше, чем ядра клеток в форме шпинделя. Выражение ВКАМ-1 было более обильным в регионах с нарушенным потоком, при меньшей кривизны арки аорты, по сравнению с регионами под устойчивым потоком, при большей кривизны арки аорты и на грудной аорте. Здесь области меньшей кривизны аорты мыши обозначены как области d-потока, и большая кривизна и грудной клетки.
При правильной модификации этот метод может быть также применен к анализу проницаемости сосудов, а также к положению макромолекул в эндотелиальной инима клетке.
