Этот метод позволяет обнаружить, неинвазивным подходом, пациента с колоректальным неопластическим поражением. В частности, этот тест позволяет, в связи с тестами в настоящее время используется в программе скрининга колоректального рака, чтобы лучше предсказать наличие рака или более высокий риск аномальных поражений. Чтобы начать этот протокол, центрифуга алицит каждого положительного контроля, стандартные ДНК, и шип в ДНК, в сухом формате в течение 10 секунд на мини центрифуге.
Повторное положительное управление с 750 микролитров воды. Повторное использование ДНК, используемой в качестве экзогенного внутреннего контроля, для проверки наличия ингибиторов со 100 микролитров воды. Для стандартной кривой, повторно поставить сухой стандарт с 100 микролитров воды и сделать четыре 1:5 разбавления, начиная с запасного раствора.
Затем тщательно вихрем реагенты в течение 15 секунд, и центрифуга в мини-центрифуге в течение 10 секунд. Для полного повторного использования храните жидкие реагенты при комнатной температуре в течение 30 минут перед использованием. Для подготовки 1x всплеска в ДНК управления, смешать пять микролитров FL-ДНК всплеск с 45 микролитров стерильной воды.
Для образцов смешайте 75 микролитров каждого образца с 50 микролитров 1x шип-в ДНК, что дает общий объем 125 микролитров. Во-первых, откройте операционное программное обеспечение qPCR. Чтобы настроить пластину, установите тип Well type для всех восьми позиций в первой колонке, как Стандарт.
Установите тип скважин для скважин A2 и B2 в качестве NTC. Установите тип Well для положительных элементов управления, C2 и D2, как Неизвестный. И установите тип Well для всех других позиций, как Неизвестный.
Выберите все 96 позиций. Добавить красители, FAM и HEX и нажмите Sync плиты. Затем установите тепловой профиль, как это предусмотрено.
Подготовьте нужное количество 8-хорошо полос, содержащих полный лиофилизированных смесей усиления, с конкретными грунтовки и зонды ориентации ДНК человека, и внутренний контроль. Чтобы довести содержимое до нижней части труб, центрифуга полосы в течение 10 секунд. Аккуратно снимите уплотнения с полосок, убедившись, что не потерять гранулы.
Затем добавьте 25 микролитров воды в скважины с отрицательным контролем. 25 микролитров образцов ДНК для образца скважин и 25 микролитров положительной контрольной ДНК к положительным контрольным скважинам. Для стандартной кривой добавьте 25 микролитров стандартных 1, 2, 3 и 4 в каждом выделенной хорошо.
Используйте 8-полосные плоские оптические колпачки, чтобы тщательно закрыть все полосы и вихрь в течение нескольких секунд. Центрифуга полос в течение 10 секунд, загрузить их в инструмент, и начать работать. В конце запуска, для FAM FL-DNA A и HEX IC, выберите столбцы, A, C, E, и G.For FAM FL-DNA B и HEX IC, выберите столбцы, B, D, F, и H.For стандартное количество количества, установить 10 нанограмм на реакцию для скважин A1 и B1, два нанограмма на реакцию для C1 и D1, точка четыре нанограмма на реакцию для E1 и F1 , и точка ноль восемь нанограмм на реакцию для G1 и H1. Затем для каналов FAM и HEX установите значения пороговой флуоресценции до 150.
В таблице результата коробки, щелкните варианты колонки, после этого, выберите все, и после этого одобрено, для того чтобы получить результаты в обоих каналах с их соответственно значениями Cq и delta R последними, которые поставлены програмным обеспечением инструмента реального времени qPCR. Последний раз Delta R соответствует значению флуоресценции, нормализуемому до последнего цикла усиления. В таблице результатов коробки, право нажмите на стол, чтобы открыть контекстное меню.
Нажмите Отправить в Excel для экспорта необработанных данных. А затем загрузите файл Excel на специальное программное обеспечение для анализа для автоматизированного расчета количества FL-ДНК. Из комбинации значений iFOBT и FL-DNA для каждого пациента, риск колоректального рака.
Кривые флуоресценции подходящего положительного образца показывают образец сигнала на канале HEX, который является внутренним контролем, в пределах приемлемого диапазона. Положительный сигнал выше порога на канале FAM, который показывает усиление генов-мишеней. Кривые флуоресценции подходящего отрицательного образца показывают образец сигнала в пределах приемлемого диапазона на канале HEX.
Отрицательный контрольный сигнал ниже порога на канале FAM. С другой стороны, кривые не подходящего образца показывают образец сигнала, который не находится в пределах приемлемого диапазона на канале HEX. Скорее всего, из-за потенциального торможения.
Таким образом, этот образец должен быть повторен, начиная с экстракции. Таблица вывода анализа программного обеспечения показывает данные как для Mix A, так и для Mix B с точки зрения концентрации FL-ДНК для контроля реакции, клинических образцов и результатов контроля качества. Образец номер четыре не имеет никаких результатов, поскольку он не прошел контроль качества.
Она должна быть повторена и повторно использована. Пожалуйста, будьте осторожны, когда повторно ДНК для всплеска в контроле стандартной кривой. И при распределении различных ДНК на 8-колодец полосы, а также во время молекулярного обнаружения в разделе анализа результатов.
Этот метод должен быть выполнен в сочетании с тестом iFOBT, чтобы обеспечить лучшую оценку колоректальных неопластических поражений, он должен быть проведен с той же фекальной выборки.
