Энтерические вирусы в основном находятся в различных водных водоемах, включая грунтовые воды, еще воду, ручьи, реки и r воды. Они связаны с риском для здоровья и несут ответственность за инфекции у людей. Кишечные вирусы обычно вызывают гастроэнтерит и в основном передаются через фекально-оральный маршрут.
Другие болезни, передаваемые через воду, вызывают острый гепатит вирусом гепатита А и вирусами гепатита Е, при этом значительная связанная с этим смертность особенно в отношении гепатита Е у беременных женщин. Фактические протоколы мониторинга качества воды, предлагаемые для гуманитарных контекстов, были разработаны такими бактериями, как E.Coli, в качестве индикатора фекального загрязнения. Но уже известно, что нет никакой корреляции с другими микроорганизмами, такими как вирусы, которые более устойчивы ко многим процессам активации.
До настоящего времени выявление вирусов в условиях гуманитарного кризиса проводилось путем адаптации существующих протоколов к условиям этих контекстов и доставки образцов в справочные лаборатории для молекулярного обнаружения вирусов. Существует необходимость в методах выявления вирусных патогенов и вирусных показателей с точки зрения снижения рисков для здоровья населения, предотвращения вспышек и повышения эффективности гуманитарных мероприятий. Мы предлагаем метод обнаружения вирусов в 10-литровых пробах воды, который делится на три этапа: концентрация вирусной, извлечения нуклеиновой кислоты и вирусного обнаружения.
Все эти шаги были адаптированы из методов, используемых в настоящее время в нашей лаборатории, и могут быть выполнены в точке зрения с помощью портативных реагентов и оборудования, производя иждивенцев питания и морозильных камер. Кроме того, в метод был добавлен консервантный раствор, который гарантирует стабильность нуклеиновых кислот для отправки в справочные лаборатории в случае необходимости. Метод, который мы предлагаем, называется VirWaTest и был разработан в сотрудничестве с GenIUL и Intermon Oxfam.
Перед началом следует рассмотреть количество образцов, которые будут протестированы для подготовки реагентов и материала. Для получения репрезентативных результатов рекомендуется собрать по две реплицы каждого образца воды. При наличии соответствующего количества материала может быть проверено одновременно несколько образцов.
Реагенты и материалы должны быть подготовлены и упакованы перед переехал или отправлены в место, где метод необходим. Перечень материалов и небольшого оборудования, которые должны быть упакованы, описан в таблице 1. Подготовьте запас бактериофагов MS2 для добавления в каждый образец воды в качестве контроля процесса, следуя соответствующему методу ISO.
Затем раздайте 10 микролитров подвески, содержащей от 10 до 10 платформер, предварительно сделанных в 10 мл трубок и дайте воде высохнуть. Потребуется одна трубка на образец воды. Кроме того, приготовьте одну трубку, содержащую 10 мл стерильной дистиллированной воды на собранный образец.
Для предварительно флоккулированного раствора обезжиренного молока приготовьте трубку, содержащую обезжиренное молоко, полиэтиленовый пакет с морской солью и пластиковую бутылку, содержащую дистиллированную воду. Для регулировки рН приготовьте трубку, содержащую лимонную кислоту, трубку, содержащую гидроксид натрия, и две пластиковые емкости с 25 и 50 мл дистиллированной воды. Для каждого образца воды, который будет протестирован, подготовить кондиционирования пакетик, добавив морские соли и лимонную кислоту в застежку-молнию полиэтиленовый пакет, и сохранение раствора, добавив буфер лиза, и консервант нуклеиновой кислоты, в 5 мл трубки.
Наконец, подготовить четыре нейтрализующих пакетики, добавив моющее средство питания в четыре молнии пластиковых пакетов. Для каждого образца воды, которые будут извлечены, подготовить одну трубку пять мл, содержащую магнитные частицы и этанол, и три 2 мл трубки, содержащие 500, 600 и 200 микролитров стиральных буферов один, два и три, соответственно, и одна трубка, содержащая буфер элюции. Два различных извлечения нуклеиновой кислоты могут быть проанализированы одновременно в каждом анализе ПЦР, если используется термоциклер Ньюэлла.
Для всех анализов ПЦР подготовьте молекулярную биологию воды. Подготовьте смеси, содержащие две грунтовки и одно доказательство, специфичное для каждого целевого вируса в зависимости от объемов и концентраций, описанных в протоколе. Для каждого вируса, добавить указанные объемы в трубки от одного до восьми труб лоток.
Разрежьте полосу, разделив ее на две полосы. Трубы от одного до пяти и трубки от шести до восьми. Для каждого вируса, воздушные сухие подвески ДНК, содержащие от 10 до 5, 10 до 7, и от 10 до 9 и известные копии предварительно сделаны в трубки шесть, семь и восемь.
Этот протокол концентрации основан на принципе органической флоккуляции, с помощью которого низкий рН и состояние высокой проводимости приводит к тому, что белки обезжиренного молока организуются в флоки, которые вирусы поглощают. После того, как флоксы урегулированы, они могут быть легко собраны. Соберите 10-литровый образец воды в ведро с плоским дном, обеспеченное крышкой.
При сборе из трубы, пусть вода работает в течение нескольких секунд, прежде чем собирать воду. Важно использовать четкие ведра для визуализации гранул. Ищите плоское пространство в свежем месте вдали от прямых солнечных лучей Положите магнитный мешалка подключен к батарее под поддержку ведра и поместите ведро, содержащее образец воды на каждой поддержке.
Пересмотрите лимонную кислоту и гидроксид натрия и встряхните, пока они полностью не растворятся. Налейте 500 мл дистиллированной воды в стоячий мешок и поместите мешок на магнитный мешалка. Добавьте содержимое одного морского соляного пакетика и содержимое одной обезжиренной молочной трубки и перемешайте в течение пяти минут со средней скоростью.
Отрегулируйте рН флоккулированного обезжиренного молока с помощью лимонной кислоты и гидроксида натрия до рН между 3,4 и 3,6. Выключите магнитный мешалку и убедитесь, что флоки видны. Фонарик может помочь в визуализации флокс.
Бросьте помешивая магнит в воду. Установите магнитный мешалка на максимальной скорости и включите его. Добавьте 10 мл дистиллированной воды в трубу, контролируемую процессом.
Инвертировать его несколько раз и залить раствором в воду. Налейте содержимое одного образца кондиционирования пакетика в воду и перемешать в течение пяти минут. Убедитесь, что рН пробы воды, которая должна быть между 3,4 и 3,6.
При необходимости отрегулируйте рН. Добавьте 100 мл предварительно сморщенного раствора обезжиренного молока, закройте ведро крышкой и оставьте воду помешивая в течение восьми часов с минимальной скоростью. Через восемь часов выключите магнитный мешалку и дайте флоксу поселиться, по крайней мере, пять дополнительных часов.
С помощью системы, основанной на использовании контроллера пипетки, пластиковой трубки и пары пипеток, откажитесь от супернатанта, заботясь о том, чтобы не беспокоить флоксы на дне ведра. Когда уровень воды вот-вот достигнет перемешивания магнита, сожмите пластиковую трубку, чтобы остановить поток воды и отойти пипетку от ведра. Встряхните ведро, чтобы повторно почистить флоксы и вылить их в стоячий полиэтиленовый пакет.
Позвольте флоксу поселиться в течение одного дополнительного часа. Тщательно аспирировать супернатант воды с помощью пипетки избегая беспокоить флокс. Аспирировать флоки с помощью пипетки и передать их в коническую трубку.
Обратите внимание на конечный объем проб концентрата и перенесите 1 мл в трубку, содержащую консервантный раствор. Подвеска может быть использована либо для выполнения добычи нуклеиновой кислоты в полевых условиях, либо отправить в справочную лабораторию для дальнейшего анализа. Вода, отбрасываемая при сборе флок, должна быть обработана до удаления.
Добавьте содержимое нейтрализуемого агента пакетика в ведро, содержащее выброшенную воду. Смешайте воду и оставьте его еще на тридцать минут. Затем утилизировать обработанную воду в качестве общих отходов.
Магнитные частицы могут передаваться из одной трубки в другую с помощью магнитной пипетки. Привыкните к работе магнитной пипетки перед выполнением извлечения. Упорядочить трубки, содержащие реагент, необходимый для извлечения в стойке.
То есть слева направо: буфер связывания, буферы для мытья и буфер elution. Перенесите 1 мл пробного концентрата в трубку, содержащую связывающий буфер, используя одноразовый пластиковый пипетку. Инвертировать трубку десять раз, чтобы оптимизировать решение.
Инкубировать раствор при комнатной температуре в течение десяти минут, непрерывно смешивая либо с помощью соло орбитальной или вручную. Соберите магнитные частицы с помощью магнитной пипетки и чистый наконечник, который может быть повторно использован для трех буферов стирки и освободить магнитные частицы в трубку, содержащую промывку буфера 1. Вымойте их, осторожно встряхивая раствор кончиком в течение тридцати секунд и собирать их.
Повторите эту процедуру стирки для мытья буферов два и три. Соберите магнитные частицы в стиральном буфере три и отпустите их в трубку, содержащую буфер элюции. Затем отбросьте наконечник.
Инкубировать раствор при комнатной температуре в течение пяти минут при непрерывном смешивании с помощью соло орбитальной. Замените наконечник на магнитной пипетке любым и соберите все магнитные частицы из буфера элюции. Отбросьте наконечник с частицами прилагается.
Нуклеиевая кислота остается в буфере элюции, который должен храниться для дальнейшего анализа или отгрузки. Используйте пятитрубную и трехтрубную полосу, подготовленную для обнаружения аденовирусов человека. Добавьте воду, смесь ПЦР и экстракции нуклеиновой кислоты в трубки от одного до пяти в соответствии с протоколом.
После этого добавьте воду и смесь ПЦР в трубки от шести до восьми. Положите обе полосы в термоциклер и выберите соответствующий пробег. После завершения времени сбора результатов и анализа полученных данных.
Только тогда, когда вирусные тесты привели к отрицательным, MS2 обнаружения должны быть выполнены. Используйте трубчатые полосы, подготовленные для обнаружения MS2, и выберите соответствующий тепловой профиль для ПЦР. Извлечение магнитной нуклеиновой кислоты VirWaTest сравнивали с вирусной РНК ЗИАгена, имитируя ее, тестируя образцы воды с аденовирусами человека и MS2.
Снижение теста p-значение показывает значительно более высокие вирусные восстановления с помощью VirWaTest, чем Зиаген в качестве метода экстракции для обоих вирусов испытания. Разработанный метод вирусной концентрации был опробован на местах в сотрудничестве с командами Оксфама, расположенными в Банги, Центральноафриканская Республика, и в Педерналесе, Эквадор, которые собирали пробы воды, концентрировали их, применяя разработанный метод концентрации, и отправляли их в лабораторию в Барселоне для извлечения нуклеиновой кислоты и вирусной количественной оценки. В Эквадоре аденовирусы человека были обнаружены во всех проверенных образцах, в то время как один из пяти образцов, собранных и сконцентрированных в Банги, дал положительный результат на аденовирусы человека.
Разработанный метод оказался полезным, когда он был оценен командами по мытью Oxfam Intermon в Банги, Центральноафриканская Республика, и другой командой в Педерналесе, Эквадор. VirWaTest может быть частью системы раннего предупреждения или может быть использован в расследовании вспышки болезни организациями, участвующими в санитарии воды. Это оборудование облегчает анализ вирусных патогенов в воде и совершенствование управления безопасностью воды с целью сокращения случаев вирусных заболеваний в условиях гуманитарного кризиса.
